പ്രോട്ടീൻ കെ എംഎൻജിഎസ് (ദ്രാവകം)
പ്രോട്ടീനേസ് കെ വിശാലമായ അടിവസ്ത്ര പ്രത്യേകതയുള്ള ഒരു സ്ഥിരതയുള്ള സെറിൻ പ്രോട്ടീസാണ്.ഡിറ്റർജൻ്റുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ പോലും ഇത് നാട്ടിലെ പല പ്രോട്ടീനുകളെ നശിപ്പിക്കുന്നു.ക്രിസ്റ്റൽ, മോളിക്യുലാർ ഘടന പഠനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള തെളിവുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് എൻസൈം ഒരു സജീവ സൈറ്റായ കാറ്റലറ്റിക് ട്രയാഡ് (Asp) ഉള്ള സബ്‌റ്റിലിസിൻ കുടുംബത്തിൽ പെട്ടതാണെന്ന്39-അദ്ദേഹത്തിന്റെ69-സർ224).തടഞ്ഞ ആൽഫ അമിനോ ഗ്രൂപ്പുകളുള്ള അലിഫാറ്റിക്, ആരോമാറ്റിക് അമിനോ ആസിഡുകളുടെ കാർബോക്‌സിൽ ഗ്രൂപ്പിനോട് ചേർന്നുള്ള പെപ്റ്റൈഡ് ബോണ്ടാണ് പിളർപ്പിൻ്റെ പ്രധാന സൈറ്റ്.അതിൻ്റെ വിശാലമായ പ്രത്യേകതയ്ക്കായി ഇത് സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഈ പ്രോട്ടീനേസ് കെ എംഎൻജിഎസിനായി പ്രത്യേകം രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിട്ടുള്ളതാണ്.മറ്റ് പ്രോട്ടീനേസ് കെയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, അതേ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രകടനത്തോടെ ഇതിലും കുറവ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് മലിനീകരണം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഇത് ഡൗൺസ്ട്രീം mNGS ആപ്ലിക്കേഷൻ മികച്ച രീതിയിൽ ഉറപ്പാക്കും.
സംഭരണ വ്യവസ്ഥകൾ
2 വർഷത്തേക്ക് 2-8℃
സ്പെസിഫിക്കേഷൻ
| രൂപഭാവം | നിറമില്ലാത്തതും ഇളം തവിട്ടുനിറത്തിലുള്ളതുമായ ദ്രാവകം |
| പ്രവർത്തനം | ≥800 U/ml |
| പ്രോട്ടീൻ ഏകാഗ്രത | ≥20 mg/ml |
| നിക്കേസ് | ഒന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല |
| DNase | ഒന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല |
| RNase | ഒന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല |
പ്രോപ്പർട്ടികൾ
| EC നമ്പർ | 3.4.21.64(ട്രിറ്റിറാച്ചിയം ആൽബത്തിൽ നിന്നുള്ള പുനഃസംയോജനം) |
| ഐസോഇലക്ട്രിക് പോയിൻ്റ് | 7.81 |
| ഒപ്റ്റിമൽ പി.എച്ച് | 7.0- 12.0 ചിത്രം 1 |
| ഒപ്റ്റിമൽ താപനില | 65 ℃ ചിത്രം 2 |
| pH സ്ഥിരത | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) ചിത്രം 3 |
| താപ സ്ഥിരത | 50 ℃-ന് താഴെ (pH 8.0, 30 മിനിറ്റ്) ചിത്രം 4 |
| സംഭരണ സ്ഥിരത | 25 ℃-ൽ 12 മാസത്തേക്ക് 90%-ത്തിലധികം പ്രവർത്തനം |
| ആക്ടിവേറ്ററുകൾ | എസ്ഡിഎസ്, യൂറിയ |
| ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ | ഡൈസോപ്രോപൈൽ ഫ്ലൂറോഫോസ്ഫേറ്റ്;phenylmethylsulfonyl ഫ്ലൂറൈഡ് |
അപേക്ഷകൾ
1. ജനിതക ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് കിറ്റ്
2. ആർഎൻഎ, ഡിഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ കിറ്റുകൾ
3. ടിഷ്യൂകളിൽ നിന്ന് പ്രോട്ടീൻ ഇതര ഘടകങ്ങളുടെ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ, ഡിഎൻഎ പോലുള്ള പ്രോട്ടീൻ മാലിന്യങ്ങളുടെ അപചയംവാക്സിനുകളും ഹെപ്പാരിൻ തയ്യാറാക്കലും
4. പൾസ്ഡ് ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി ക്രോമസോം ഡിഎൻഎ തയ്യാറാക്കൽ
5. വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട്
6. എൻസൈമാറ്റിക് ഗ്ലൈക്കോസൈലേറ്റഡ് ആൽബുമിൻ റിയാജൻ്റുകൾ ഇൻ വിട്രോ ഡയഗ്നോസിസ്
മുൻകരുതലുകൾ
ഉപയോഗിക്കുമ്പോഴോ തൂക്കം കൂട്ടുമ്പോഴോ സംരക്ഷണ കയ്യുറകളും കണ്ണടകളും ധരിക്കുക, ഉപയോഗത്തിന് ശേഷം നന്നായി വായുസഞ്ചാരമുള്ളതാക്കുക.ഈ ഉൽപ്പന്നം ചർമ്മത്തിന് അലർജി പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിനും ഗുരുതരമായ കണ്ണ് പ്രകോപിപ്പിക്കലിനും കാരണമാകും.ശ്വസിക്കുകയാണെങ്കിൽ, അത് അലർജിയോ ആസ്ത്മ ലക്ഷണങ്ങളോ ശ്വാസതടസ്സമോ ഉണ്ടാക്കാം.ശ്വാസോച്ഛ്വാസം പ്രകോപിപ്പിക്കാം.
യൂണിറ്റ് നിർവചനം
ഒരു യൂണിറ്റ് (U) എന്നത് 1 μmol ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് കസീൻ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് ആവശ്യമായ എൻസൈമിൻ്റെ അളവാണ്.ഇനിപ്പറയുന്ന വ്യവസ്ഥകളിൽ മിനിറ്റിൽ ടൈറോസിൻ.
ഘടകങ്ങളുടെ തയ്യാറെടുപ്പ്
Reagent I: 1g പാൽ കസീൻ 50ml 0.1M സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ലായനിയിൽ (pH 8.0) ലയിപ്പിച്ചു, 65-70 ℃ വെള്ളത്തിൽ 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, ഇളക്കി അലിയിച്ചു, വെള്ളത്തിൽ തണുപ്പിച്ചു, സോഡിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് pH 8.0 ആയി ക്രമീകരിച്ചു, വോളിയം നിശ്ചയിച്ചു. 100 മില്ലി
റീജൻ്റ് II: 0.1M ട്രൈക്ലോറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ്, 0.2M സോഡിയം അസറ്റേറ്റ്, 0.3M അസറ്റിക് ആസിഡ്.
റീജൻ്റ് III: 0.4M Na2CO3പരിഹാരം.
റീജൻ്റ് IV: ശുദ്ധജലത്തിൽ 5 തവണ ലയിപ്പിച്ച ഫോറിൻ്റ് റീജൻ്റ്.
റീജൻ്റ് വി: എൻസൈം ഡൈലൻ്റ്: 0.1 എം സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ലായനി (പിഎച്ച് 8.0).
റീജൻ്റ് VI: ടൈറോസിൻ ലായനി: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml ടൈറോസിൻ 0.2 ഉപയോഗിച്ച് അലിഞ്ഞുഎം എച്ച്സിഎൽ.
നടപടിക്രമം
1. 0.5ml reagent I 37℃ വരെ ചൂടാക്കി, 0.5ml എൻസൈം ലായനി ചേർക്കുക, നന്നായി ഇളക്കുക, ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക10 മിനിറ്റിന് 37℃.
2. പ്രതികരണം നിർത്താൻ 1ml റീജൻ്റ് II ചേർക്കുക, നന്നായി ഇളക്കുക, 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേഷൻ തുടരുക.
3. സെൻട്രിഫഗേറ്റ് പ്രതികരണ പരിഹാരം.
4. 0.5ml സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് എടുക്കുക, 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV എന്നിവ ചേർത്ത് നന്നായി ഇളക്കി 37℃-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.30 മിനിറ്റ്.
5. ഒ.ഡി660OD ആയി നിശ്ചയിച്ചു1;ബ്ലാങ്ക് കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പ്: എൻസൈം മാറ്റിസ്ഥാപിക്കാൻ 0.5ml റീജൻ്റ് V ഉപയോഗിക്കുന്നുOD നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള പരിഹാരം660OD ആയി2, ΔOD=OD1-ഒ.ഡി2.
6. എൽ-ടൈറോസിൻ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്: 0.5mL വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതയുള്ള എൽ-ടൈറോസിൻ ലായനി, 2.5mL റീജൻ്റ് III, 5mL സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ 0.5mL റീജൻ്റ് IV, 37 ഡിഗ്രിയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, OD-ക്കായി കണ്ടെത്തുക660എൽ-ടൈറോസിൻ വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതയ്ക്ക്, തുടർന്ന് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് Y=kX+b ലഭിച്ചു, ഇവിടെ Y എന്നത് L-ടൈറോസിൻ സാന്ദ്രതയാണ്, X ആണ് OD600.
കണക്കുകൂട്ടല്
2: പ്രതിപ്രവർത്തന പരിഹാരത്തിൻ്റെ ആകെ അളവ് (mL)
0.5: എൻസൈം ലായനിയുടെ അളവ് (mL)
0.5: ക്രോമോജെനിക് നിർണ്ണയത്തിൽ (mL) ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രതികരണ ദ്രാവക അളവ്
10: പ്രതികരണ സമയം (മിനിറ്റ്)
Df: നേർപ്പിക്കൽ ഒന്നിലധികം
Cഎൻസൈം സാന്ദ്രത (mg/mL)
റഫറൻസുകൾ
1. Wieger U & Hilz H. FEBS ലെറ്റ്.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.ജീവശാസ്ത്രം.Res.കമ്യൂൺ(1971);44:513.
3. ഹിൽസ്, എച്ച്.തുടങ്ങിയവർ.,യൂറോ.ജെ. ബയോകെം.(1975);56:103-108.
4. സംബ്രൂക്ക് ജെet അൽ., മോളിക്യുലാർ ക്ലോണിംഗ്: എ ലബോറട്ടറി മാനുവൽ, രണ്ടാം പതിപ്പ്, കോൾഡ് സ്പ്രിംഗ് ഹാർബർലബോറട്ടറി പ്രസ്സ്, കോൾഡ് സ്പ്രിംഗ് ഹാർബർ (1989).
കണക്കുകൾ
അത്തിപ്പഴം.1 ഒപ്റ്റിമം pH
100mM ബഫർ പരിഹാരം:pH6.0-8.0, Na-ഫോസ്ഫേറ്റ്;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.എൻസൈം സാന്ദ്രത:1mg/mL
ചിത്രം.2 ഒപ്റ്റിമൽ താപനില
20 എംഎം കെ-ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ പിഎച്ച് 8.0-ലെ പ്രതികരണം.എൻസൈം സാന്ദ്രത: 1 മില്ലിഗ്രാം / മില്ലി
Fig.3 pH സ്ഥിരത
25 ℃, 50 mM ബഫർ ലായനി ഉപയോഗിച്ച് 16 h-ചികിത്സ: pH 4.5- 5.5, അസറ്റേറ്റ്;pH 6.0-8.0, Na-ഫോസ്ഫേറ്റ്;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.എൻസൈം സാന്ദ്രത: 1 മില്ലിഗ്രാം / മില്ലി
Fig.4 തെർമൽ സ്ഥിരത
50 mM Tris-HCl ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 30 മിനിറ്റ് ചികിത്സ, pH 8.0.എൻസൈം സാന്ദ്രത: 1 മില്ലിഗ്രാം / മില്ലി
ചിത്രം.5 സംഭരണം സ്ഥിരതty at 25℃
