നേരിട്ട് PCR കിറ്റ് നടുക
പൂച്ച നമ്പർ: HCR2020A
പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് പിസിആർ കിറ്റ് ചെടിയുടെ ഇലകൾ, വിത്തുകൾ മുതലായവ നേരിട്ട് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് അനുയോജ്യമാണ്, കൂടാതെ പോളിസാക്രറൈഡുകളും പോളിഫെനോളുകളും അടങ്ങിയിട്ടില്ലാത്ത സസ്യ സാമ്പിളുകളുടെ ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് സ്ക്രീനിംഗിനായി ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.നേരിട്ടുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് സസ്യങ്ങളിലെ പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകളോട് മികച്ച സഹിഷ്ണുതയുണ്ട്.അതേസമയം, ഇത് ഉയർന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രകടനം നിലനിർത്തുന്നു, ഇത് 5 കെബിയ്ക്കുള്ളിൽ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് അനുയോജ്യമാണ്.കിറ്റിലെ അദ്വിതീയമായ ലിസിസ് ബഫർ എ ചെടിയുടെ പുതിയതോ ശീതീകരിച്ചതോ ആയ ടിഷ്യൂകൾ ലൈസ് ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കാം.ഇത് പ്രവർത്തിപ്പിക്കാൻ എളുപ്പമാണ്, കൂടാതെ ശുദ്ധീകരണമില്ലാതെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ലൈസേറ്റ് ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കാം.ആവർത്തിച്ചുള്ള ഫ്രീസിംഗിനും ഉരുകിയതിനും ശേഷം ക്രൂഡ് സാമ്പിളുകൾ ഫലപ്രദമായി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ പ്രാപ്തമാക്കുന്ന സംരക്ഷിത ഏജൻ്റുകൾ സിസ്റ്റത്തിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.2 × പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് മാസ്റ്റർ മിക്സിന് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ റിയാക്ഷൻ നടത്താൻ പ്രൈമറുകളും ടെംപ്ലേറ്റുകളും ചേർക്കേണ്ടതുണ്ട്, അതുവഴി പൈപ്പറ്റിംഗ് പ്രവർത്തനങ്ങൾ കുറയ്ക്കുകയും ഫലങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തൽ ത്രൂപുട്ടും പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും മെച്ചപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.
ഘടകങ്ങൾ
| ഘടകങ്ങൾ | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് മാസ്റ്റർ മിക്സ് | 1.25 മില്ലി | 4×1.25 മില്ലി |
| പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലിസിസ് ബഫർ എ | 5 മില്ലി | 20 മില്ലി |
| പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലിസിസ് ബഫർ ബി* | 5 മില്ലി | 20 മില്ലി |
*പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ ബി എന്നത് ഒരു ഓപ്ഷണൽ റിയാജൻ്റാണ്, ഇത് സാമ്പിളുകളുടെ സംഭരണ സമയം ദീർഘിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ എ നിർവീര്യമാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.യഥാർത്ഥ സാഹചര്യത്തിനനുസരിച്ച് ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.
സംഭരണ വ്യവസ്ഥകൾ
2 × പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് മാസ്റ്റർ മിക്സ്, -30 ~ -15℃ സംഭരിക്കുക, ആവർത്തിച്ചുള്ള മരവിപ്പിക്കലും ഉരുകലും ഒഴിവാക്കുക;പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ, -30 ~ -15℃ അല്ലെങ്കിൽ 2 ~ 8℃.
പരീക്ഷണ പ്രക്രിയ
സാമ്പിൾ പ്രോസസ്സിംഗ്–ചെടിയുടെ ഇല
നേരിട്ടുള്ള രീതി:ഇളം ഇലകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ചെറുതും ഏകീകൃതവുമായ സാമ്പിൾ ലഭിക്കുന്നതിന് 0.5 - 3 മില്ലീമീറ്റർ നിശ്ചിത വ്യാസമുള്ള ഒരു ദ്വാര പഞ്ച് ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് PCR സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് നേരിട്ട് സാമ്പിൾ ചേർക്കുക (50 μl സിസ്റ്റം ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു).ശ്രദ്ധിക്കുക, സാമ്പിൾ പിസിആർ ലായനിയിലാണെന്നും ട്യൂബ് മതിലിന് എതിരല്ലെന്നും ഉറപ്പാക്കുക.ദൈർഘ്യമേറിയ ശകലങ്ങളും സങ്കീർണ്ണമായ സാമ്പിളുകളും വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഡയറക്ട് പിസിആർ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ചെറിയ വ്യാസമുള്ള (0.5 - 1 മി.മീ.) ഒരു സാമ്പിൾ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നത് മികച്ച ഫലങ്ങൾ നേടാൻ സഹായിക്കും.
ഗ്രൈൻഡിംഗ് ലിസിസ് രീതി:ഇളം ഇലകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ഇലയുടെ ഒരു ചെറിയ കഷണം (ഏകദേശം 1 - 3 മില്ലിമീറ്റർ വ്യാസം) എടുക്കുക, അത് 20 μl പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ എബിയിൽ വയ്ക്കുക, കഴിയുന്നത്ര പൊടിക്കുക (100 μl പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ഇല പിഴിഞ്ഞ് ഈ ഘട്ടം ചെയ്യാം. സാമ്പിൾ മാഷ് ചെയ്യാൻ) .ഇല ടിഷ്യുവിൻ്റെ വലിയ അളവുകൾ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ (7 മില്ലീമീറ്ററിൽ കൂടരുത്), ഡില്യൂഷൻ ബഫറിൻ്റെ അളവ് 50 μl ആയി വർദ്ധിപ്പിക്കുക.ഇലകൾ പൊടിച്ചതിനുശേഷം, പരിഹാരം പച്ചയായി കാണപ്പെടും.ഒരു ചെറിയ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം, ഒരു പ്രതികരണ ടെംപ്ലേറ്റായി PCR സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് 1 μl സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് ചേർക്കുക.
തെർമൽ ലിസിസ് രീതി:ഇളം ഇലകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ഇലയുടെ ഒരു ചെറിയ കഷണം (ഏകദേശം 1 - 3 മില്ലിമീറ്റർ വ്യാസം) എടുക്കുക, 20 μl പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ എയിൽ വയ്ക്കുക, 95 ° C താപനിലയിൽ 5 - 10 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക.ലൈസ് ചെയ്യാൻ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള ഇലകൾക്ക് (20 മിനിറ്റിൽ കൂടരുത്) ലിസിസ് സമയം ഉചിതമായി നീട്ടാവുന്നതാണ്.ഇല ടിഷ്യുവിൻ്റെ വലിയ അളവുകൾ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ (7 മില്ലീമീറ്ററിൽ കൂടരുത്), ഡില്യൂഷൻ ബഫറിൻ്റെ അളവ് 50 μl ആയി വർദ്ധിപ്പിക്കുക.ചൂടാക്കിയ ശേഷം, ചുരുക്കത്തിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക, കൂടാതെ 1 μl സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് PCR സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് ഒരു പ്രതികരണ ടെംപ്ലേറ്റ് ആയി ചേർക്കുക.
സാമ്പിൾ പ്രോസസ്സിംഗ്- വിത്ത് നടുക
ഗ്രൈൻഡിംഗ് ലിസിസ് രീതി:5 മില്ലിമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള വിത്തുകൾ മുറിക്കാൻ ഒരു സ്കാൽപെൽ ഉപയോഗിക്കുക, അവയെ 100 μl പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ എയിൽ ചേർക്കുക, കൂടാതെ ഒരു പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പോ മറ്റ് ഉപകരണങ്ങളോ ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ പൊടിക്കുക.ചുഴലിക്കാറ്റ് ചുരുക്കി ഊഷ്മാവിൽ 3 - 5 മിനിറ്റ് നിൽക്കട്ടെ.വിത്ത് സാമ്പിൾ ഡൈല്യൂഷൻ ബഫറിൽ മുങ്ങിയിരിക്കുകയാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.ഒരു ഹ്രസ്വ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം, ഒരു പ്രതികരണ ടെംപ്ലേറ്റായി പിസിആർ സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് സൂപ്പർനാറ്റൻ്റിൻറെ 1 μl ചേർക്കുക.
തെർമൽ ലിസിസ് രീതി:5 മില്ലിമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള വിത്തുകൾ മുറിക്കാൻ ഒരു സ്കാൽപെൽ ഉപയോഗിക്കുക, അവയെ 100 μl പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലൈസിസ് ബഫർ എയിൽ ചേർക്കുക, 95 ° C താപനിലയിൽ 5 - 10 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക.ലൈസ് ചെയ്യാൻ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള (30 മിനിറ്റിൽ കൂടരുത്) ഇലകൾക്ക് ലിസിസ് സമയം ഉചിതമായി നീട്ടാവുന്നതാണ്.ചൂടാക്കിയ ശേഷം, ചുരുക്കത്തിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക, കൂടാതെ 1 μl സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് PCR സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് ഒരു പ്രതികരണ ടെംപ്ലേറ്റായി ചേർക്കുക.
എ.അനുയോജ്യമായ വലിപ്പത്തിലുള്ള സാമ്പിളുകൾ മുറിക്കുന്നതിന് കത്രികയോ മറ്റ് ഉപകരണങ്ങളോ ഉപയോഗിക്കാം;പഞ്ച് അല്ലെങ്കിൽ കത്രിക വീണ്ടും ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, സാമ്പിളുകൾ തമ്മിലുള്ള മലിനീകരണം തടയുന്നതിന് ഓരോ ഉപയോഗത്തിനും മുമ്പായി 2% സോഡിയം ഹൈപ്പോക്ലോറൈറ്റ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് വൃത്തിയാക്കണം.
ബി.ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലിസിസ് ബഫർ പൂർണ്ണമായും ഉരുകിയെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.ബഫർ വിസ്കോസ് ആണെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടെങ്കിൽ, അത് 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ചൂടാക്കി ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് പൂർണ്ണമായും ഉരുകിപ്പോകും.
സി.പ്ലാൻ്റ് മെറ്റീരിയലിൻ്റെയും ലയിപ്പിച്ചതിൻ്റെയും അളവിലെ വ്യത്യാസം അനുസരിച്ച് പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലെ ടെംപ്ലേറ്റിൻ്റെ അളവ് ഉചിതമായി ക്രമീകരിക്കാൻ കഴിയും.
പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലിസിസ് ബഫർ
ഈ ഉൽപ്പന്നത്തിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലിസിസ് ബഫർ എ, മിക്ക സസ്യകോശങ്ങളുടെയും ജീനോം പുറത്തുവിടുന്നതിന് കർശനമായി ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ 4℃-ൽ അസംസ്‌കൃത സസ്യങ്ങളുടെ ഹ്രസ്വകാല സംഭരണത്തിന് അനുയോജ്യമാണ്.സാമ്പിൾ കൂടുതൽ സമയത്തേക്ക് (ഉദാ, 1 - 2 മാസം) സൂക്ഷിക്കണമെങ്കിൽ, സൂപ്പർനറ്റൻ്റ് ഒരു പുതിയ ഇപി ട്യൂബിലേക്ക് മാറ്റി -20 ഡിഗ്രിയിൽ സൂക്ഷിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.സാമ്പിളുകൾ കൂടുതൽ സുസ്ഥിരമായി സംഭരിക്കുന്നതിന്, ട്രാൻസ്ഫർ ചെയ്ത സൂപ്പർനാറ്റൻ്റിലേക്ക് തുല്യ അളവിലുള്ള പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് ലിസിസ് ബഫർ ബി ചേർക്കുക, നന്നായി ഇളക്കി -20 ഡിഗ്രിയിൽ സൂക്ഷിക്കുക.പ്ലാൻ്റ് സാമ്പിളുകളും സംസ്ഥാനങ്ങളും അനുസരിച്ച് സ്ഥിരമായ സംഭരണ സമയം വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു.
പ്രതികരണ സംവിധാനം
| ddH2O | 20.0 µl വരെ | 50.0 µl വരെ |
| 2 × പ്ലാൻ്റ് ഡയറക്ട് മാസ്റ്റർ മിക്സ്a | 10.0 µl | 25.0 µ |
| പ്രൈമർ 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| പ്രൈമർ 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ചെടിയുടെ ഇല/ക്രൂഡ് എക്സ്ട്രാക്റ്റ് സാമ്പിൾ(സാമ്പിൾ പ്രോസസ്സിംഗ് കാണുക) | 0.5 – 3 mm ഇല ഡിസ്ക്/x µl | 0.5 – 3 mm ഇല ഡിസ്ക്/x µl |
എ.ഇതിൽ Mg അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു2+2 mM ൻ്റെ അന്തിമ സാന്ദ്രതയിൽ.
ബി.ഓരോ പ്രൈമറിനും 0.4μM അന്തിമ സാന്ദ്രത ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.പ്രൈമറുകളുടെ അമിതമായ ഉപയോഗം, നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കും.
സി.ഉപയോഗിച്ച സാമ്പിളിൻ്റെ അളവ് യഥാർത്ഥ സാഹചര്യത്തിനനുസരിച്ച് ക്രമീകരിക്കാവുന്നതാണ്.ക്രൂഡ് ലൈസ്ഡ് സാമ്പിളിൻ്റെ ഒരൊറ്റ പ്രതികരണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന തുക പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൻ്റെ മൊത്തം വോളിയത്തിൻ്റെ 2% മുതൽ 20% വരെ ക്രമീകരിക്കാം.വളരെയധികം സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പരാജയത്തിന് കാരണമാകും.
പ്രതികരണ പരിപാടി
| പടികൾ | താപനില | സമയം |
| പ്രാരംഭ ഡീനാറ്ററേഷൻ | 98℃ | 5 മിനിറ്റ് |
| ഡീനാറ്ററേഷൻ | 95℃ | 10 സെ |
| അനീലിംഗ് | 58 ~ 72℃ | 15 സെ |
| വിപുലീകരണം | 72℃ | 30 സെ |
| അന്തിമ വിപുലീകരണം | 72℃ | 5 മിനിറ്റ് |
എ.പ്രാരംഭ ഡീനാറ്ററേഷൻ (98℃, 5 മിനിറ്റ്) പ്ലാൻ്റ് ടിഷ്യുവിൻ്റെ ലിസിസ് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഉപയോഗിക്കാവുന്ന ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ പുറത്തുവിടുന്നു.സമയം കുറയ്ക്കുകയോ താപനില കുറയ്ക്കുകയോ ചെയ്യരുത്.
ബി.ഇത് പ്രൈമർ Tm മൂല്യത്തിന് തുല്യമോ Tm മൂല്യത്തേക്കാൾ 2 ~ 4℃ കൂടുതലോ സജ്ജമാക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ഈ ഉൽപ്പന്നത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ഡയറക്ട് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് പരമ്പരാഗത ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്, കൂടാതെ പ്രതികരണ അനീലിംഗ് താപനിലയ്ക്ക് പ്രത്യേക ആവശ്യകതകളും ഉണ്ട്; ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനിലയുടെ ഉപയോഗം നിർദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഫലപ്രദമായി കുറയ്ക്കുകയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യും.സങ്കീർണ്ണമായ ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക്, അനീലിംഗ് താപനില ക്രമീകരിച്ചും വിപുലീകരണ സമയം നീട്ടിക്കൊണ്ടും കാര്യക്ഷമമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ നേടാനാകും.
സി.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിൻ്റെ ദൈർഘ്യം ≤1 kb ആണെങ്കിൽ, വിപുലീകരണ സമയം 30 സെക്കൻ്റ്/kb ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു;ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിൻ്റെ ദൈർഘ്യം >1 kb ആണെങ്കിൽ, വിപുലീകരണ സമയം 60 സെക്കൻ്റ്/kb ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഡി.സങ്കീർണ്ണമായ സാമ്പിളുകൾ അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വിളവ് ഉള്ള സാമ്പിളുകൾക്കായി, സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം ഉചിതമായി 40 -50 സൈക്കിളുകളായി വർദ്ധിപ്പിക്കാം.
അപേക്ഷകൾ
പ്ലാൻ്റ് ടിഷ്യൂകളുടെ നേരിട്ടുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും പോളിസാക്രറൈഡുകളും പോളിഫെനോളുകളും അടങ്ങിയിട്ടില്ലാത്ത സസ്യ സാമ്പിളുകളുടെ ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് സ്‌ക്രീനിംഗിനും ഇത് ബാധകമാണ്.
കുറിപ്പുകൾ
ഗവേഷണ ഉപയോഗത്തിന് മാത്രം.ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് നടപടിക്രമങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കാനുള്ളതല്ല.
1. ക്രൂഡ് പ്ലാൻ്റ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനോ നേരിട്ടുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷനോ, സിസ്റ്റവും പ്രൈമറുകളും പ്രവർത്തനങ്ങളും ശരിയാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ പരീക്ഷണം ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് പോസിറ്റീവ് കൺട്രോളായി ശുദ്ധീകരിച്ച ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
2. ഈ കിറ്റിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ഡയറക്ട് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് ശക്തമായ പ്രൂഫ് റീഡിംഗ് പ്രവർത്തനമുണ്ട്.ടിഎ ക്ലോണിംഗ് നടത്തേണ്ടതുണ്ടെങ്കിൽ, അഡിനൈൻ ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഡിഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
3. പ്രൈമർ ഡിസൈൻ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശം:
എ.പ്രൈമറിൻ്റെ 3′ അറ്റത്തുള്ള അവസാനത്തെ അടിസ്ഥാനം G അല്ലെങ്കിൽ C ആയിരിക്കണമെന്ന് ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
ബി.പ്രൈമറിൻ്റെ 3′ അറ്റത്തുള്ള അവസാന 8 ബേസുകളിൽ തുടർച്ചയായ പൊരുത്തക്കേടുകൾ ഒഴിവാക്കണം.സി.പ്രൈമറിൻ്റെ 3′ അറ്റത്തുള്ള ഹെയർപിൻ ഘടനകൾ ഒഴിവാക്കുക.
ഡി.ഫോർവേഡ് പ്രൈമറിൻ്റെയും റിവേഴ്‌സ് പ്രൈമറിൻ്റെയും Tm മൂല്യത്തിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ 1℃-ൽ കൂടുതലാകരുത്, Tm മൂല്യം 60 ~ 72℃ ആയി ക്രമീകരിക്കണം (Tm മൂല്യം കണക്കാക്കാൻ പ്രൈമർ പ്രീമിയർ 5 ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു).
ഇ.പ്രൈമർ Tm മൂല്യം കണക്കാക്കുമ്പോൾ ടെംപ്ലേറ്റുമായി പൊരുത്തപ്പെടാത്ത അധിക പ്രൈമർ സീക്വൻസുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തരുത്.
എഫ്.പ്രൈമറിൻ്റെ GC ഉള്ളടക്കം 40% -60% ആയിരിക്കണമെന്ന് ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
ജി.പ്രൈമറിലെ എ, ജി, സി, ടി എന്നിവയുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള വിതരണം കഴിയുന്നത്ര തുല്യമായിരിക്കണം.ഉയർന്ന GC അല്ലെങ്കിൽ AT ഉള്ളടക്കമുള്ള പ്രദേശങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കുക.
എച്ച്.പ്രൈമറിനുള്ളിലോ രണ്ട് പ്രൈമറുകൾക്കിടയിലോ അഞ്ചോ അതിലധികമോ ബേസുകളുടെ കോംപ്ലിമെൻ്ററി സീക്വൻസുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഒഴിവാക്കുക, രണ്ട് പ്രൈമറുകളുടെ 3′ അറ്റത്ത് മൂന്നോ അതിലധികമോ ബേസുകളുടെ കോംപ്ലിമെൻ്ററി സീക്വൻസുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഒഴിവാക്കുക.
ഐ.വ്യക്തമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ തടയാൻ പ്രൈമറിൻ്റെ പ്രത്യേകത പരിശോധിക്കാൻ NCBI BLAST ഫംഗ്‌ഷൻ ഉപയോഗിക്കുക.
