RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്
3'→5' എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം ഇല്ലാത്തതും RNase H പ്രവർത്തനമുള്ളതുമായ ഒരു RNA ടെംപ്ലേറ്റ്-ആശ്രിത DNA പോളിമറേസാണ് RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്.ഈ എൻസൈമിന് ഡിഎൻഎയുടെ ഒരു കോംപ്ലിമെൻ്ററി സ്ട്രാൻഡ് സമന്വയിപ്പിക്കുന്നതിന് ആർഎൻഎയെ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് ഫസ്റ്റ്-സ്ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിൽ പ്രയോഗിക്കാൻ കഴിയും, പ്രത്യേകിച്ച് ആർടി-ലാംപിന് (ലൂപ്പ്-മെഡിയേറ്റഡ് ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ).RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് 1.0-മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, സെൻസിറ്റിവിറ്റി ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെട്ടു, താപ സ്ഥിരത ശക്തമാണ്, 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലുള്ള പ്രതികരണം കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് (ഗ്ലിസറോൾ ഫ്രീ) ലയോഫിലൈസ്ഡ് തയ്യാറെടുപ്പുകൾ, ലയോഫിലൈസ് ചെയ്ത RT-LAMP റിയാഗൻ്റുകൾ മുതലായവ തയ്യാറാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കാം.
യൂണിറ്റ് നിർവ്വചനം
ഒരു യൂണിറ്റ് പോളി(A)•oligo(dT)25 ടെംപ്ലേറ്റ്-പ്രൈമറായി ഉപയോഗിച്ച് 50°C-ൽ 20 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 1 nmol dTTP-യെ ആസിഡ്-പ്രിസിപിറ്റബിൾ മെറ്റീരിയലിലേക്ക് സംയോജിപ്പിക്കുന്നു.
ഘടകങ്ങൾ
| ഘടകം | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് (ഗ്ലിസറോൾ-ഫ്രീ) (15U/μL) | 0.1 മി.ലി | 1 മി.ലി | 10 മി.ലി |
| 10×HC RTL ബഫർ | 1.5 മി.ലി | 4×1.5 മില്ലി | 5×10 മില്ലി |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 മി.ലി | 2×1.5 മില്ലി | 3×10 മില്ലി |
സ്റ്റോറേജ് അവസ്ഥ
0 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ താഴെയുള്ള ഗതാഗതം, -25°C~-15°C-ൽ സൂക്ഷിക്കുക.
ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണം
- ൻ്റെ ശേഷിക്കുന്ന പ്രവർത്തനംEndonuclease:1 μg λDNA യും 15 യൂണിറ്റ് RTL2.0 യും അടങ്ങിയ 50 μL പ്രതികരണം 16 മണിക്കൂർ 37 ℃-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തത് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് വഴിയുള്ള നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണത്തിൻ്റെ അതേ പാറ്റേൺ കാണിക്കുന്നു.
- ൻ്റെ ശേഷിക്കുന്ന പ്രവർത്തനംഎക്സോന്യൂക്ലീസ്:1 μg ഹിന്ദ് Ⅲ ദഹിപ്പിച്ച λDNA, 15 യൂണിറ്റ് RTL2.0 എന്നിവ അടങ്ങിയ 50 μL പ്രതികരണം 16 മണിക്കൂർ 37 ℃-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തത് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസിൻ്റെ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണത്തിൻ്റെ അതേ പാറ്റേൺ കാണിക്കുന്നു.
- ൻ്റെ ശേഷിക്കുന്ന പ്രവർത്തനംനിക്കേസ്:1 μg സൂപ്പർകോൾഡ് pBR322, 15 യൂണിറ്റ് RTL2.0 എന്നിവ അടങ്ങിയ 50 μL പ്രതികരണം 4 മണിക്കൂർ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തത് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസിൻ്റെ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണത്തിൻ്റെ അതേ പാറ്റേൺ കാണിക്കുന്നു.
- ൻ്റെ ശേഷിക്കുന്ന പ്രവർത്തനംRNase:0.48 μg MS2 RNA, 15 യൂണിറ്റ് RTL2.0 എന്നിവ അടങ്ങിയ 10 μL പ്രതികരണം 4 മണിക്കൂർ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തത് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസിൻ്റെ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണത്തിൻ്റെ അതേ പാറ്റേൺ കാണിക്കുന്നു.
- ഇ.കോളി gDNA:ഉപയോഗിച്ച് അളന്നുഇ.കോളിപ്രത്യേക HCD ഡിറ്റക്ഷൻ കിറ്റുകൾ，ആർടിഎൽ2.0-ൻ്റെ 15 യൂണിറ്റുകളിൽ 1-ൽ താഴെ മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂഇ.കോളിജനിതകഘടന.
പ്രതികരണ സജ്ജീകരണം
cDNA സിന്തസിസ് പ്രോട്ടോക്കോൾ
| ഘടകങ്ങൾ | വ്യാപ്തം |
| ടെംപ്ലേറ്റ് RNA a | ഓപ്ഷണൽ |
| ഒലിഗോ(dT) 18~25(50uM) അല്ലെങ്കിൽ റാൻഡം പ്രൈമർ മിക്സ്(60uM) | 2 μL |
| dNTP മിക്സ് (10mM വീതം) | 1 μL |
| RNase ഇൻഹിബിറ്റർ (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL ബഫർ | 2 μL |
| ന്യൂക്ലീസ് രഹിത വെള്ളം | 20 μL വരെ |
കുറിപ്പുകൾ:
1) മൊത്തം RNA യുടെ ശുപാർശ ചെയ്യപ്പെടുന്ന അളവ് 1ng~1μg ആണ്
2) mRNA യുടെ ശുപാർശിത അളവ് 50ng~100ng ആയിരുന്നു
തെർമോ-സൈക്കിൾ ചവിട്ടുന്നതിനുള്ള വ്യവസ്ഥകൾ പ്രതികരണം:
| താപനില (°C) | സമയം |
| 25 °Ca | 5 മിനിറ്റ് |
| 55 °C | 10 മിനിറ്റ്b |
| 80 °C | 10 മിനിറ്റ് |
കുറിപ്പുകൾ:
1) റാൻഡം പ്രൈമർ മിക്സ് ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, 25 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ ഘട്ടം.
2) ടാർഗെറ്റ് പ്രൈമർ മിശ്രിതമാണ് ഉപയോഗിക്കുന്നതെങ്കിൽ, 10~30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ ഘട്ടം.
RT-LAMP പ്രോട്ടോക്കോൾ
| ഘടകങ്ങൾ | വ്യാപ്തം | അന്തിമ ഏകാഗ്രത |
| ടെംപ്ലേറ്റ് RNA | ഓപ്ഷണൽ | ≥10 പകർപ്പുകൾ |
| dNTP മിക്സ് (10mM) | 3.5 μL | 1.4 എംഎം |
| FIP/BIP പ്രൈമറുകൾ (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 പ്രൈമറുകൾ (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB പ്രൈമറുകൾ (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase ഇൻഹിബിറ്റർ (40U/μL) | 0.5 μL | 20 യു/പ്രതികരണം |
| RTL റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/പ്രതികരണം |
| Bst V2 DNA പോളിമറേസ് (8U/μL) | 1 μL | 8 യു/പ്രതികരണം |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (ആകെ 8 mM) |
| 10×HC RTL ബഫർ (അല്ലെങ്കിൽ 10×HC Bst V2 ബഫർ) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| ന്യൂക്ലീസ് രഹിത വെള്ളം | 25 μL വരെ | - |
കുറിപ്പുകൾ:
1) വോർട്ടക്‌സിംഗ് വഴി മിക്സ് ചെയ്യുക, ശേഖരിക്കാൻ ചുരുക്കത്തിൽ അപകേന്ദ്രീകരണം.1 മണിക്കൂർ 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സ്ഥിരമായ താപനില ഇൻകുബേഷൻ.
2) രണ്ട് ബഫറുകളും പരസ്പരം പ്രവർത്തിക്കാവുന്നതും ഒരേ ഘടനയുള്ളതുമാണ്.
കുറിപ്പുകൾ
1.-20 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കുമ്പോൾ ഈ ഉൽപ്പന്നം വെളുത്ത ഖരരൂപത്തിലാകും.-20 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നിന്ന് എടുത്ത് ഏകദേശം 10 മിനിറ്റ് ഐസിൽ വയ്ക്കുക.ഉരുകിയ ശേഷം ഇളക്കി ഇളക്കി ഉപയോഗിക്കാം.
2. cDNA ഉൽപ്പന്നം -20°C അല്ലെങ്കിൽ -80°C-ൽ സൂക്ഷിക്കാം അല്ലെങ്കിൽ PCR പ്രതികരണത്തിനായി ഉടനടി ഉപയോഗിക്കാവുന്നതാണ്.
3. RNase മലിനീകരണം തടയാൻ, ദയവായി പരീക്ഷണ പ്രദേശം വൃത്തിയായി സൂക്ഷിക്കുക, പ്രവർത്തന സമയത്ത് വൃത്തിയുള്ള കയ്യുറകളും മാസ്കുകളും ധരിക്കുക.
