പ്രോട്ടീൻ കെ എൻജിഎസ് (പൊടി)
പൂച്ച നമ്പർ: HC4507A
ഉയർന്ന എൻസൈം പ്രവർത്തനവും വൈഡ് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് പ്രത്യേകതയും ഉള്ള ഒരു സ്ഥിരതയുള്ള സെറിൻ പ്രോട്ടീസാണ് NGS പ്രോട്ടീസ് കെ. ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിനോ ആസിഡുകൾ, സൾഫർ അടങ്ങിയ അമിനോ ആസിഡുകൾ, ആരോമാറ്റിക് അമിനോ ആസിഡുകൾ എന്നിവയുടെ സി-ടെർമിനലിനോട് ചേർന്നുള്ള ഈസ്റ്റർ ബോണ്ടുകളും പെപ്റ്റൈഡ് ബോണ്ടുകളും എൻസൈം മുൻഗണനയായി വിഘടിപ്പിക്കുന്നു.അതിനാൽ, പ്രോട്ടീനുകളെ ചെറിയ പെപ്റ്റൈഡുകളായി തരംതാഴ്ത്താൻ ഇത് പലപ്പോഴും ഉപയോഗിക്കുന്നു.NGS പ്രോട്ടീസ് കെ ആസ്പിയുള്ള ഒരു സാധാരണ സെറിൻ പ്രോട്ടീസാണ്39-അദ്ദേഹത്തിന്റെ69-സർ224സെറിൻ പ്രോട്ടീസുകൾക്ക് മാത്രമുള്ള കാറ്റലിറ്റിക് ട്രയാഡ്, കാറ്റലറ്റിക് സെൻ്റർ ടോവ് Ca കൊണ്ട് ചുറ്റപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു2+സ്ഥിരതയ്ക്കായി ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകൾ, വിശാലമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഉയർന്ന എൻസൈം പ്രവർത്തനം നിലനിർത്തുന്നു.
സ്പെസിഫിക്കേഷൻ
| രൂപഭാവം | വൈറ്റ് മുതൽ ഓഫ്-വൈറ്റ് അമോർഫസ് പൗഡർ, ലയോഫിലൈസ്ഡ് |
| പ്രത്യേക പ്രവർത്തനം | ≥40U/mg ഖര |
| DNase | ഒന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല |
| RNase | ഒന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല |
| ബയോബർഡൻ | ≤50CFU/g ഖര |
| ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് അവശിഷ്ടം | <5pg/mg ഖര |
പ്രോപ്പർട്ടികൾ
| ഉറവിടം | ട്രൈറ്റിറാച്ചിയം ആൽബം |
| EC നമ്പർ | 3.4.21.64(ട്രിറ്റിറാച്ചിയം ആൽബത്തിൽ നിന്നുള്ള പുനഃസംയോജനം) |
| തന്മാത്രാ ഭാരം | 29kDa (SDS-പേജ്) |
| ഐസോഇലക്ട്രിക് പോയിൻ്റ് | 7.81 ചിത്രം.1 |
| ഒപ്റ്റിമൽ പി.എച്ച് | 7.0-12.0 (എല്ലാവരും ഉയർന്ന പ്രവർത്തനം നടത്തുന്നു) ചിത്രം.2 |
| ഒപ്റ്റിമൽ താപനില | 65℃ ചിത്രം.3 |
| pH സ്ഥിരത | pH 4.5-12.5 (25℃,16h) ചിത്രം.4 |
| താപ സ്ഥിരത | 50℃-ന് താഴെ (പിഎച്ച് 8.0, 30മിനിറ്റ്) ചിത്രം.5 |
| സംഭരണ സ്ഥിരത | 25℃-ൽ 12 മാസത്തേക്ക് സംഭരിച്ചിരിക്കുന്നു ചിത്രം.6 |
| ആക്ടിവേറ്ററുകൾ | എസ്ഡിഎസ്, യൂറിയ |
| ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ | ഡൈസോപ്രോപൈൽ ഫ്ലൂറോഫോസ്ഫേറ്റ്;benzylsulfonyl ഫ്ലൂറൈഡ് |
സംഭരണ വ്യവസ്ഥകൾ
ലൈയോഫിലൈസ് ചെയ്ത പൊടി -25~-15 ℃-ൽ വെളിച്ചത്തിൽ നിന്ന് വളരെക്കാലം സൂക്ഷിക്കുക;പിരിച്ചുവിട്ടതിന് ശേഷം, ലൈറ്റിൽ നിന്ന് 2-8℃ അകലെയുള്ള ഹ്രസ്വകാല സംഭരണത്തിനായി ഉചിതമായ വോളിയത്തിലേക്ക് അലിഖോട്ട് അല്ലെങ്കിൽ പ്രകാശത്തിൽ നിന്ന് -25~-15 ℃ അകലെ ദീർഘകാല സംഭരണം.
മുൻകരുതലുകൾ
ഉപയോഗിക്കുമ്പോഴോ തൂക്കം കൂട്ടുമ്പോഴോ സംരക്ഷണ കയ്യുറകളും കണ്ണടകളും ധരിക്കുക, ഉപയോഗത്തിന് ശേഷം നന്നായി വായുസഞ്ചാരമുള്ളതാക്കുക.ഈ ഉൽപ്പന്നം ചർമ്മത്തിന് അലർജി പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിനും ഗുരുതരമായ കണ്ണ് പ്രകോപിപ്പിക്കലിനും കാരണമാകും.ശ്വസിക്കുകയാണെങ്കിൽ, അത് അലർജിയോ ആസ്ത്മ ലക്ഷണങ്ങളോ ശ്വാസതടസ്സമോ ഉണ്ടാക്കാം.ശ്വാസോച്ഛ്വാസം പ്രകോപിപ്പിക്കാം.
യൂണിറ്റ് നിർവചനം
NGS പ്രോട്ടീസ് കെ യുടെ ഒരു യൂണിറ്റ്, സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡിറ്റർമിനേഷൻ വ്യവസ്ഥകളിൽ കസീൻ 1 μmol എൽ-ടൈറോസിൻ ആയി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാൻ ആവശ്യമായ എൻസൈമിൻ്റെ അളവാണ്.
ഘടകങ്ങളുടെ തയ്യാറെടുപ്പ്
| റീജൻ്റ് | നിർമ്മാതാവ് | കാറ്റലോഗ് |
| കസീൻ സാങ്കേതികപശുവിൻ പാലിൽ നിന്ന് | സിഗ്മ ആൽഡ്രിച്ച് | C7078 |
| NaOH | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 10019762 |
| NaH2PO4·2എച്ച്2O | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 20040718 |
| Na2HPO4 | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 20040618 |
| ട്രൈക്ലോറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ് | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 80132618 |
| സോഡിയം അസറ്റേറ്റ് | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 10018818 |
| അസറ്റിക് ആസിഡ് | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 10000218 |
| HCl | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 10011018 |
| സോഡിയം കാർബണേറ്റ് | സിനോഫാം കെമിക്കൽറീജൻ്റ് കോ., ലിമിറ്റഡ് | 10019260 |
| ഫോളിൻ-ഫിനോൾ | സാങ്കോൺ ബയോടെക് (ഷാങ്ഹായ്)ക്ലിപ്തം. | A500467-0100 |
| എൽ-ടൈറോസിൻ | സിഗ്മ | 93829 |
റീജൻ്റ് I:
സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ്: പശുവിൻ പാൽ ലായനിയിൽ നിന്നുള്ള 1% കസീൻ: 1 ഗ്രാം ബോവിൻ മിൽക്ക് കസീൻ 50 മില്ലി 0.1 എം സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ലായനിയിൽ പിഎച്ച് 8.0 ലയിപ്പിക്കുക, വാട്ടർ ബാത്തിൽ 65-70 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 15 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക, ഇളക്കി അലിയിക്കുക, വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് തണുപ്പിക്കുക, ക്രമീകരിച്ചത് സോഡിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് pH 8.0 ആക്കി 100ml വരെ നേർപ്പിക്കുക.
റീജൻ്റ് II:
TCA ലായനി: 0.1M ട്രൈക്ലോറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ്, 0.2M സോഡിയം അസറ്റേറ്റ്, 0.3M അസറ്റിക് ആസിഡ് (ഭാരം 1.64g ട്രൈക്ലോറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ് + 1.64g സോഡിയം അസറ്റേറ്റ് + 1.724mL അസറ്റിക് ആസിഡ് തുടർച്ചയായി, 50mL ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിലേക്ക് 50mL ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ ചേർക്കുക, H40mL ഡിയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ ചേർക്കുക 100 മില്ലി).
റീജൻ്റ് III:
0.4m സോഡിയം കാർബണേറ്റ് ലായനി (4.24g അൺഹൈഡ്രസ് സോഡിയം കാർബണേറ്റ് തൂക്കി 100mL വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിക്കുക)
റീജൻ്റ് IV:
ഫോളിൻ ഫിനോൾ റീജൻ്റ്: ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ 5 തവണ നേർപ്പിക്കുക.
റീജൻ്റ് വി:
എൻസൈം ഡൈലൻ്റ്: 0.1 എം സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ലായനി, പിഎച്ച് 8.0.
റീജൻ്റ് VI:
എൽ-ടൈറോസിൻ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ലായനി:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml എൽ-ടൈറോസിൻ 0.2M HCl ഉപയോഗിച്ച് അലിഞ്ഞു.
നടപടിക്രമം
1. UV-Vis സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഓണാക്കി ഫോട്ടോമെട്രിക് അളവ് തിരഞ്ഞെടുക്കുക.
2. തരംഗദൈർഘ്യം 660nm ആയി സജ്ജമാക്കുക.
3. വാട്ടർ ബാത്ത് ഓണാക്കുക, താപനില 37℃ ആയി സജ്ജമാക്കുക, 3-5 മിനിറ്റ് താപനില മാറ്റമില്ലാതെ ഉറപ്പാക്കുക.
4. 0.5mL സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് 2mL സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ 37℃ വാട്ടർ ബാത്തിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ചൂടാക്കുക.
5. പ്രീഹീറ്റ് ചെയ്ത സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 0.5mL നേർപ്പിച്ച എൻസൈം ലായനി വേർതിരിച്ചെടുക്കുക.ശൂന്യഗ്രൂപ്പായി എൻസൈം ഡൈലൻ്റ് സജ്ജമാക്കുക.
6. പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം ഉടൻ തന്നെ 1.0 mL TCA റീജൻ്റ് ചേർക്കുക.നന്നായി ഇളക്കി 30 മിനിറ്റ് വാട്ടർ ബാത്തിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
7. സെൻട്രിഫഗേറ്റ് പ്രതികരണ പരിഹാരം.
8. വ്യക്തമാക്കിയ ക്രമത്തിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഘടകങ്ങൾ ചേർക്കുക.
| റീജൻ്റ് | വ്യാപ്തം |
| സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് | 0.5 മി.ലി |
| 0.4M സോഡിയം കാർബണേറ്റ് | 2.5 മി.ലി |
| ഫോളിൻ ഫിനോൾ റീജൻ്റ് | 0.5 മി.ലി |
9. വാട്ടർ ബാത്തിൽ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് നന്നായി ഇളക്കുക.
10. ഒ.ഡി660OD ആയി നിശ്ചയിച്ചു1;ബ്ലാങ്ക് കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പ്: OD നിർണ്ണയിക്കാൻ എൻസൈം ലായനി മാറ്റി പകരം വയ്ക്കാൻ എൻസൈം ഡൈലൻ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു660OD ആയി2, ΔOD=OD1-ഒ.ഡി2.
11. എൽ-ടൈറോസിൻ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്: 0.5mL വ്യത്യസ്ത കോൺസൺട്രേഷൻ എൽ-ടൈറോസിൻ ലായനി, 2.5mL 0.4M സോഡിയം കാർബണേറ്റ്, 5mL സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ 0.5mL ഫോളിൻ ഫിനോൾ റീജൻ്റ്, 37 ഡിഗ്രിയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, OD-ക്കായി കണ്ടെത്തുക660എൽ-ടൈറോസിൻ്റെ വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതയ്ക്ക്, പിന്നീട് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് Y=kX+b ലഭിച്ചു, ഇവിടെ Y എന്നത് L-ടൈറോസിൻ സാന്ദ്രതയാണ്, X ആണ് OD600.
കണക്കുകൂട്ടല്
2: പ്രതിപ്രവർത്തന പരിഹാരത്തിൻ്റെ ആകെ അളവ് (mL)
0.5: എൻസൈം ലായനിയുടെ അളവ് (mL)
0.5: ക്രോമോജെനിക് നിർണ്ണയത്തിൽ (mL) ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രതികരണ ദ്രാവക അളവ്
10: പ്രതികരണ സമയം (മിനിറ്റ്)
Df: നേർപ്പിക്കൽ ഒന്നിലധികം
Cഎൻസൈം സാന്ദ്രത (mg/mL)
കണക്കുകൾ
Fig.1 DNA അവശിഷ്ടം
| സാമ്പിൾ | ഏവ് C4 | ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വീണ്ടെടുക്കൽ (pg/mg) | വീണ്ടെടുക്കൽ(%) | മൊത്തം ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ( pg/mg) |
| പി.ആർ.കെ | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-ഫ്രീ H2O | നിശ്ചയിച്ചിട്ടില്ല | — | — | — |
ചിത്രം.2 ഒപ്റ്റിമൽ പി.എച്ച്
ചിത്രം.3 ഒപ്റ്റിമൽ താപനില
Fig.4 pH സ്ഥിരത
Fig.5 താപ സ്ഥിരത
ചിത്രം.6 25℃-ൽ സ്റ്റോറേജ് സ്ഥിരത
