എൻഡോഫ്രീ പ്ലാസ്മിഡ് മാക്സി കിറ്റ്
150 - 300 മില്ലി ബാക്ടീരിയൽ ലായനിയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഈ കിറ്റ് ഉചിതമാണ്, ബാക്ടീരിയയെ ലൈസ് ചെയ്യാൻ മെച്ചപ്പെടുത്തിയ എസ്‌ഡിഎസ്-ആൽക്കലൈൻ ലിസിസ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് സംസ്‌കരിക്കുന്നു.ക്രൂഡ് എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റ് ഒരു അദ്വിതീയ എൻഡോടോക്സിൻ സ്‌കാവെഞ്ചറുമായി തിരഞ്ഞെടുത്ത് സംയോജിപ്പിച്ച് എൻഡോടോക്സിൻ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി വേർതിരിച്ചിരിക്കുന്നു.തുടർന്ന്, സിലിക്ക ജെൽ മെംബ്രൺ ഉയർന്ന ഉപ്പും കുറഞ്ഞ പിഎച്ച് അവസ്ഥയിലും ലായനിയിൽ പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.മാലിന്യങ്ങളും മറ്റ് ബാക്ടീരിയ ഘടകങ്ങളും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി വാഷ് ബഫർ ചേർക്കുന്നു.അവസാനമായി, സിലിക്കൺ മാട്രിക്സ് മെംബ്രണിൽ നിന്ന് ശുദ്ധമായ പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയെ പുറന്തള്ളാൻ ഒരു കുറഞ്ഞ ഉപ്പ്, ഉയർന്ന പിഎച്ച് എല്യൂഷൻ ബഫർ ഉപയോഗിക്കുന്നു.സിലിക്ക ജെൽ മെംബ്രൺ പ്രത്യേക അഡോർപ്ഷൻ മെംബ്രൺ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ നിരയും നിരയും തമ്മിലുള്ള അഡോർപ്ഷൻ തുക വ്യത്യാസം വളരെ ചെറുതാണ്, ആവർത്തനക്ഷമത നല്ലതാണ്.ഫിനോൾ, ക്ലോറോഫോം, മറ്റ് വിഷ ഘടകങ്ങൾ എന്നിവ ആവശ്യമില്ല, കൂടാതെ എത്തനോൾ മഴയുടെ ഘട്ടങ്ങളും ആവശ്യമില്ല.80% -90% എക്സ്ട്രാക്ഷൻ റേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് 0.2 -1.5 മില്ലിഗ്രാം ശുദ്ധമായ ഹൈ-കോപ്പി പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ അതിവേഗം വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഈ കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കാം.എൻഡോടോക്സിൻ നീക്കം ചെയ്യുന്ന ഒരു അദ്വിതീയ പ്രക്രിയ ഫോർമുലയാണ് കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നത്, എൻഡോടോക്സിൻ ഉള്ളടക്കം വളരെ കുറവാണ്, സെൽ ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ പ്രഭാവം മികച്ചതാണ്.വേർതിരിച്ചെടുത്ത പ്ലാസ്മിഡ് എൻസൈം ദഹനം, പിസിആർ, ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, ട്രാൻസ്ഫോർമേഷൻ, സീക്വൻസിങ്, മറ്റ് മോളിക്യുലാർ ബയോളജി പരീക്ഷണങ്ങൾ എന്നിവയിൽ നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കാം.
സംഭരണ വ്യവസ്ഥകൾ
RNaseA -30 ~ -15℃-ൽ സൂക്ഷിക്കുകയും ≤0℃-ൽ കൊണ്ടുപോകുകയും വേണം.
എൻഡോടോക്സിൻ സ്കാവഞ്ചർ ഒരു മാസത്തേക്ക് 2 ~ 8℃, ദീർഘകാല സംഭരണത്തിനായി -30 ~ -15℃ വരെ സൂക്ഷിക്കാം.കൂടാതെ ≤0℃ ന് കൊണ്ടുപോകുന്നു.
മറ്റ് ഘടകങ്ങൾ ഊഷ്മാവിൽ (15 ~25℃) സൂക്ഷിക്കുകയും ഊഷ്മാവിൽ കൊണ്ടുപോകുകയും വേണം.
ഘടകങ്ങൾ
| ഘടകങ്ങൾ | 10RXNS |
| ആർനേസ് എ | 750 μL |
| ബഫർ P1 | 75 മില്ലി |
| ബഫർ P2 | 75 മില്ലി |
| ബഫർ P4 | 75 മില്ലി |
| എൻഡോടോക്സിൻ സ്കാവഞ്ചർ | 25 മില്ലി |
| ബഫർ PW | 2 × 22 മില്ലി |
| ബഫർ ടി.ബി | 20 മില്ലി |
| FastPure DNA മാക്സി നിരകൾ (ഓരോന്നും 50ml കളക്ഷൻ ട്യൂബിൽ) | 10 |
| എൻഡോടോക്സിൻ രഹിത ശേഖരണ ട്യൂബ് | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA നീക്കം ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ബഫർ P1:ബാക്ടീരിയൽ സസ്പെൻഷൻ ബഫർ, ആദ്യ ഉപയോഗത്തിന് മുമ്പ് RNaseA ബഫർ P1-ലേക്ക് ചേർക്കുക.
ബഫർ P2:ബാക്ടീരിയൽ ലിസിസ് ബഫർ (SDS/NaOH അടങ്ങിയത്).
ബഫർ P4:ന്യൂട്രലൈസിംഗ് ബഫർ.
എൻഡോടോക്സിൻ സ്കാവഞ്ചർ:ക്രൂഡ് പ്ലാസ്മിഡ് സത്തിൽ നിന്ന് എൻഡോടോക്സിൻ ഫലപ്രദമായി നീക്കം ചെയ്യുക.
ബഫർ PW:ബഫർ കഴുകുക, ആദ്യ ഉപയോഗത്തിന് മുമ്പ് നിശ്ചിത അളവിൽ എത്തനോൾ ചേർക്കുക.
ബഫർ ടിബി:എല്യൂഷൻ ബഫർ.
FastPure DNA മാക്സി നിരകൾ:പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ അഡോർപ്ഷൻ നിരകൾ.
ശേഖരണ ട്യൂബുകൾ 50 മില്ലി:ഫിൽട്രേറ്റ് ശേഖരണ ട്യൂബുകൾ.
എൻഡോടോക്സിൻ രഹിത ശേഖരണ ട്യൂബ്:പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ശേഖരണ ട്യൂബുകൾ.
തയ്യാറാക്കിയ മെറ്റീരിയലുകൾ
സമ്പൂർണ്ണ എത്തനോൾ, ഐസോപ്രോപനോൾ, 50 മില്ലി റൗണ്ട്-ബോട്ടം സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകൾ, 50 മില്ലി എൻഡോടോക്സിൻ രഹിതംസെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകൾ.
അപേക്ഷകൾ
150 - 300 മില്ലി ബാക്ടീരിയൽ ലായനിയിൽ നിന്ന് പ്ലാസ്മിഡുകൾ വലിയ തോതിൽ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഈ ഉൽപ്പന്നം അനുയോജ്യമാണ്.ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് സംസ്ക്കരിച്ചു.
പരീക്ഷണ പ്രക്രിയ
1. 150 - 200 മില്ലി (300 മില്ലിയിൽ കൂടരുത്) ബാക്ടീരിയൽ ലായനി ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് സംസ്കരിച്ച് സെൻട്രിഫ്യൂജ് എടുക്കുക1 - 2 മിനിറ്റിന് ഏകദേശം 11,000 ആർപിഎം (12,000 × ഗ്രാം).സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് ഉപേക്ഷിച്ച് ബാക്ടീരിയകൾ ശേഖരിക്കുക.
Δ 50 മില്ലിയിൽ കൂടുതൽ ബാക്ടീരിയൽ ലായനി ശേഖരിക്കുമ്പോൾ, ബാക്ടീരിയൽ ലായനി, സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ, സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് ഉപേക്ഷിച്ച്, അതേ 50 മില്ലി ട്യൂബിൽ മറ്റ് ഘട്ടങ്ങൾ എന്നിവ ചേർത്ത് ബാക്ടീരിയകൾ ശേഖരിക്കാം.
ഒന്നിലധികം തവണ.
2. സെൻട്രിഫ്യൂജിലേക്ക് 7.5 മില്ലി ബഫർ P1 ചേർക്കുക (ദയവായി RNaseA ബഫർ P1-ലേക്ക് ചേർത്തിട്ടുണ്ടോയെന്ന് പരിശോധിക്കുക)ബാക്ടീരിയ അടങ്ങിയ ട്യൂബ് വോർടെക്‌സ് അല്ലെങ്കിൽ പൈപ്പറ്റിംഗ് വഴി നന്നായി ഇളക്കുക.
Δ ഈ ഘട്ടത്തിൽ ബാക്ടീരിയയുടെ പൂർണ്ണമായ പുനരുജ്ജീവനം വിളവ് ലഭിക്കുന്നതിന് നിർണ്ണായകമാണ്, പുനരാരംഭിച്ചതിന് ശേഷം ബാക്ടീരിയ കൂട്ടങ്ങൾ ഉണ്ടാകരുത്.നന്നായി കലർന്നിട്ടില്ലാത്ത ബാക്റ്റീരിയൽ ക്ലമ്പുകൾ ഉണ്ടെങ്കിൽ, അത് ലിസിസിനെ ബാധിക്കും, ഫലമായി കുറഞ്ഞ വിളവും പരിശുദ്ധിയും.ബാക്ടീരിയൽ ലായനിയുടെ OD600 0.65 ആണെങ്കിൽ, 150 മില്ലി ബാക്ടീരിയൽ ലായനിയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ 7.5 മില്ലി ബഫർ P1 ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു;OD600 0.75 ആയിരിക്കുമ്പോൾ, 8 മില്ലി ബഫർ P1 ഉപയോഗിക്കുകയും ബഫർ P2, P4 എന്നിവയുടെ അളവുകൾ അതിനനുസരിച്ച് മാറ്റുകയും വേണം.ബാക്ടീരിയൽ ലായനിയുടെ അളവ് 200 മില്ലി ആയി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയാണെങ്കിൽ, അത് ശുപാർശ ചെയ്യുന്നുബഫറുകൾ P1, P2, P4 എന്നിവയുടെ അളവ് ആനുപാതികമായി വർദ്ധിപ്പിക്കും.
3. സ്റ്റെപ്പ് 2-ൽ നിന്നുള്ള ബാക്ടീരിയൽ സസ്പെൻഷനിലേക്ക് 7.5 മില്ലി ബഫർ പി2 ചേർത്ത് 6-8 വരെ പതുക്കെ മുകളിലേക്കും താഴേക്കും ഇളക്കുക.തവണ ഊഷ്മാവിൽ 4 - 5 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
Δ നന്നായി മിക്സ് ചെയ്യാൻ സൌമ്യമായി വിപരീതമാക്കുക.ചുഴലിക്കാറ്റ് ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ വിഘടനത്തിന് കാരണമാകും, അതിൻ്റെ ഫലമായി വേർതിരിച്ചെടുത്ത പ്ലാസ്മിഡിൽ ജനിതക ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ ഉണ്ടാകും.ഈ സമയത്ത്, ലായനി വിസ്കോസും അർദ്ധസുതാര്യവും ആയിത്തീരുന്നു, ഇത് ബാക്ടീരിയകൾ പൂർണ്ണമായും ലൈസ് ചെയ്തതായി കാണിക്കുന്നു.പ്ലാസ്മിഡുകളുടെ നാശം ഒഴിവാക്കാൻ ദൈർഘ്യം 5 മിനിറ്റിൽ കൂടരുത്.പരിഹാരം വ്യക്തമല്ലെങ്കിൽ, ധാരാളം ബാക്ടീരിയകൾ ഉണ്ടാകാംഅപൂർണ്ണമായ ലിസിസ്, അതിനാൽ ബാക്ടീരിയയുടെ അളവ് ഉചിതമായി കുറയ്ക്കണം.
4. സ്റ്റെപ്പ് 3 മുതൽ ബാക്ടീരിയൽ സസ്പെൻഷനിലേക്ക് 7.5 മില്ലി ബഫർ പി 4 ചേർക്കുക, ഉടൻ തന്നെ 6 - 8 തവണ സൌമ്യമായി വിപരീതമാക്കുക, ബഫർ പി 2 പൂർണ്ണമായും നിർവീര്യമാക്കാൻ പരിഹാരം അനുവദിക്കുക.ഈ സമയത്ത്, വെളുത്ത ഫ്ലോക്കുലൻ്റ് അവശിഷ്ടം പ്രത്യക്ഷപ്പെടണം.ഏകദേശം 11,000 ആർപിഎമ്മിൽ (12,000 × ഗ്രാം) 10 - 15 മിനിറ്റിൽ കൂടുതൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ്, സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് ഒരു പുതിയ 50 മില്ലി റൗണ്ട്-ബോട്ടം സെന്‌ട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് (സ്വയം-തയ്യാറാക്കിയത്) ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം പിപ്പറ്റ് ചെയ്യുക.ഫ്ലോട്ടിംഗ് വൈറ്റ് പ്രൊസിപിറ്റേറ്റ് ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്യുക.
Δ ബഫർ P4 ചേർക്കുക, നന്നായി ഇളക്കാൻ ഉടൻ വിപരീതമാക്കുക.ന്യൂട്രലൈസേഷനെ ബാധിച്ചേക്കാവുന്ന പ്രാദേശിക മഴയുടെ ഉത്പാദനം തടയുന്നതിന് ലായനിയിൽ ഉടനീളം വെളുത്ത അവശിഷ്ടം തുല്യമായി വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നതുവരെ ട്യൂബ് നിൽക്കാൻ വിടുക.അപകേന്ദ്രീകരണത്തിന് മുമ്പ് ഏകീകൃത വെളുത്ത ഫ്ലോക്കുലൻ്റ് അവശിഷ്ടം ഇല്ലെങ്കിൽ, സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് വ്യക്തമല്ലെങ്കിൽ, ട്യൂബ്മറ്റൊരു 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു.
5. എൻഡോടോക്സിൻ സ്‌കാവെഞ്ചറിൻ്റെ വോളിയത്തിൻ്റെ 0. 1 മടങ്ങ് (സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് വോളിയത്തിൻ്റെ 10%, ഏകദേശം 2.2 മില്ലി) 4-ാം ഘട്ടത്തിൽ നിന്ന് സൂപ്പർനാറ്റൻ്റിലേക്ക് ചേർക്കുക, മിക്സ് ചെയ്യാൻ വിപരീതമാക്കുക.ലായനി ഒരു ഐസ് ബാത്തിൽ വയ്ക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ക്രഷ്ഡ് ഐസിലേക്ക് (അല്ലെങ്കിൽ റഫ്രിജറേറ്റർ ഫ്രീസറിൽ) 5 മിനിറ്റ് ഇടുക.ചെറുതായി പ്രക്ഷുബ്ധമായത്), ഇടയ്ക്കിടെ പല തവണ ഇളക്കുക.
Δ എൻഡോടോക്സിൻ സ്കാവഞ്ചർ സൂപ്പർനാറ്റൻ്റിലേക്ക് ചേർത്തതിനുശേഷം, സൂപ്പർനറ്റൻ്റ് പ്രക്ഷുബ്ധമാകും, പക്ഷേഐസ് ബാത്തിൽ തണുപ്പിച്ചതിന് ശേഷം സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് വ്യക്തമാകണം (അല്ലെങ്കിൽ ചെറുതായി പ്രക്ഷുബ്ധമാകണം).
6. സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് 10 - 15 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ (>25℃) വെച്ച ശേഷം, അത് പ്രക്ഷുബ്ധമാകുംഅതിൻ്റെ ഊഷ്മാവ് ഊഷ്മാവിൽ വർദ്ധിക്കുന്നു.അപ്പോൾ സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് മിക്സ് ചെയ്യാൻ വിപരീതമാക്കണം.
Δ മുറിയിലെ ഊഷ്മാവ് കുറവാണെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ നിങ്ങൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്ന സമയം കുറയ്ക്കാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്നുവെങ്കിൽ, സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് 37 ~ 42 ℃ വാട്ടർ ബാത്തിൽ 5 - 10 മിനിറ്റ് നേരം ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യാം, സൂപ്പർനറ്റൻ്റിന് ശേഷം അടുത്ത ഘട്ടം നടത്താം.പ്രക്ഷുബ്ധമാകുന്നു.
7. ഘട്ടം വേർതിരിക്കുന്നതിന്, ഏകദേശം 11,000 ആർപിഎമ്മിൽ (12,000 × g) റൂം ഊഷ്മാവിൽ (താപനില >25℃ ആയിരിക്കണം) 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക.മുകളിലെ ജലീയ ഘട്ടത്തിൽ ഡിഎൻഎ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, താഴ്ന്ന നീല എണ്ണമയമുള്ള ഘട്ടം പാളിയിൽ എൻഡോടോക്സിനും മറ്റ് മാലിന്യങ്ങളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.കൈമാറുകഡിഎൻഎ അടങ്ങിയ ജലീയ ഘട്ടം ഒരു പുതിയ ട്യൂബിലേക്കുംഎണ്ണമയമുള്ള പാളി ഉപേക്ഷിക്കുക.
Δ ഫലപ്രദമായ ഘട്ടം വേർതിരിക്കാത്തതിനാൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ സമയത്ത് താപനില 25℃ ആയിരിക്കണംതാപനില വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ സംഭവിക്കുന്നു.
Δ ഘട്ടം വേർതിരിക്കുന്നത് ഫലപ്രദമല്ലെങ്കിൽ, സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ താപനില 30℃ ആയി ക്രമീകരിക്കാം.സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ സമയം 15 മിനിറ്റായി വർദ്ധിപ്പിക്കാം.
Δ എൻഡോടോക്സിനും മറ്റ് മാലിന്യങ്ങളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നതിനാൽ നീല എണ്ണമയമുള്ള പാളി വലിച്ചെടുക്കരുത്.
മെക്കാനിസം
റെസസ്പെൻഷൻ ലിസിസ് ന്യൂട്രലൈസേഷൻ
◇ 7.5 മില്ലി ബഫർ P1 ചേർക്കുക
◇ 7.5 മില്ലി ബഫർ P2 ചേർക്കുക
◇ 7.5 മില്ലി ബഫർ P4 ചേർക്കുക
എൻഡോടോക്സിൻ നീക്കം
◇എൻഡോടോക്സിൻ സ്കാവഞ്ചറിൻ്റെ സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് വോളിയത്തിൻ്റെ 0. 1 മടങ്ങ് ചേർക്കുക
ബൈൻഡിംഗും കഴുകലും
◇ ഐസോപ്രോപനോളിൻ്റെ 0.5 മടങ്ങ് വോളിയം ചേർക്കുക
◇ 10 മില്ലി ബഫർ PW ചേർക്കുക
◇ 10 മില്ലി ബഫർ PW ചേർക്കുക
എല്യൂഷൻ
◇ 1 - 2 മില്ലി ബഫർ ടിബി അല്ലെങ്കിൽ എൻഡോടോക്സിൻ രഹിത ddH2O ചേർക്കുക
