വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം

വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം, വാക്സിനിയ ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈമിനുള്ള ജീനുകളെ വഹിക്കുന്ന ഇ.ഈ ഒരൊറ്റ എൻസൈമിന് രണ്ട് ഉപഘടകങ്ങൾ (D1, D12) ചേർന്നതാണ്, കൂടാതെ മൂന്ന് എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനങ്ങളുമുണ്ട് (ആർഎൻഎ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റസും ഗ്വാനൈൽട്രാൻസ്ഫെറേസും ഡി1 ഉപയൂണിറ്റും ഗ്വാനൈൻ മെഥിൽട്രാൻസ്ഫെറേസും ഡി12 ഉപയൂണിറ്റും).വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം ക്യാപ് ഘടനയുടെ രൂപവത്കരണത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ ഫലപ്രദമാണ്, ഇത് ആർഎൻഎയുടെ 5′ അറ്റത്ത് 7-മെഥൈൽഗുവാനിലേറ്റ് ക്യാപ് ഘടന (m7Gppp, Cap 0) ഘടിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.എംആർഎൻഎ സ്ഥിരത, ഗതാഗതം, യൂക്കറിയോട്ടുകളിലെ വിവർത്തനം എന്നിവയിൽ ക്യാപ് ഘടന (ക്യാപ് 0) ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.എൻസൈമാറ്റിക് റിയാക്ഷൻ വഴി RNA ക്യാപ്പിംഗ് ചെയ്യുന്നത് ഫലപ്രദവും ലളിതവുമായ ഒരു രീതിയാണ്, ഇത് ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ, ട്രാൻസ്‌ഫെക്ഷൻ, മൈക്രോ ഇൻജക്ഷൻ എന്നിവയ്‌ക്കായി ആർഎൻഎയുടെ സ്ഥിരതയും വിവർത്തനവും ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയും.

ഘടകങ്ങൾ

വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം (10 U/μL)

10× ക്യാപ്പിംഗ് ബഫർ

സംഭരണ ​​വ്യവസ്ഥകൾ

സംഭരണത്തിനായി -25～- 15℃ (ആവർത്തിച്ചുള്ള ഫ്രീസ്-ഥോ സൈക്കിളുകൾ ഒഴിവാക്കുക)

സംഭരണ ​​ബഫർ

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% ട്രൈറ്റൺ X- 100, 50% ഗ്ലിസറോൾ.

യൂണിറ്റ് നിർവ്വചനം

വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈമിൻ്റെ ഒരു യൂണിറ്റ് 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 10pmol GTP 80nt ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിലേക്ക് 1 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ സംയോജിപ്പിക്കാൻ ആവശ്യമായ എൻസൈമിൻ്റെ അളവാണ്.

ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണം

എക്സോന്യൂക്ലീസ്:10U വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം 1μg λ-ഹിന്ദ് III ഡൈജസ്റ്റ് ഡിഎൻഎ 37 ℃ 16 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത് പോലെ യാതൊരു ഡീഗ്രേഡേഷനും നൽകുന്നില്ല.

എൻഡോ ന്യൂക്ലീസ്:10U വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം 1μg λDNA 37℃ 16 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത് പോലെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ നൽകുന്നില്ല.

നിക്കേസ്:10U വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം 1 μg pBR322 37 ℃ 16 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത് പോലെ ഒരു ഡീഗ്രേഡേഷൻ നൽകുന്നു.

RNase:1.6μg MS2 RNA ഉള്ള 10U വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം 37 ഡിഗ്രിയിൽ 4 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന തരത്തിൽ ജീർണ്ണത നൽകുന്നില്ല.

1.കോളി ഡിഎൻഎ:E. coli 16S rRNA ലോക്കസിനുള്ള പ്രത്യേക പ്രൈമറുകൾക്കൊപ്പം TaqMan qPCR ഉപയോഗിച്ച് E. coli genomic DNA യുടെ സാന്നിധ്യത്തിനായി 10U വാക്സിനിയ വൈറസ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം പരിശോധിക്കുന്നു.E. coli genomic DNA മലിനീകരണം≤1 E. coli ജീനോം ആണ്.

2.ബാക്ടീരിയ എൻഡോടോക്സിൻ: LAL-ടെസ്റ്റ്, ചൈനീസ് ഫാർമക്കോപ്പിയ IV 2020 പതിപ്പ് അനുസരിച്ച്, ജെൽ ലിമിറ്റ് ടെസ്റ്റ് രീതി, പൊതു നിയമം (1143).ബാക്ടീരിയൽ എൻഡോടോക്സിൻ ഉള്ളടക്കം ≤10 EU/mg ആയിരിക്കണം.

പ്രതികരണ സംവിധാനവും വ്യവസ്ഥകളും

1. ക്യാപ്പിംഗ് പ്രോട്ടോക്കോൾ (പ്രതികരണ വോളിയം: 20 μL)

ഈ നടപടിക്രമം 10μg RNA (≥100 nt) യുടെ ക്യാപ്പിംഗ് പ്രതികരണത്തിന് ബാധകമാണ്, കൂടാതെ ഇത് പരീക്ഷണാത്മക ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

I) 1.5 മില്ലി മൈക്രോഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ 10μg ആർഎൻഎയും ന്യൂക്ലീസ്-ഫ്രീ H2Oയും 15.0 µL എന്ന അന്തിമ വോള്യത്തിലേക്ക് സംയോജിപ്പിക്കുക.*10×ക്യാപ്പിംഗ് ബഫർ: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) 65 ഡിഗ്രിയിൽ 5 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക, തുടർന്ന് 5 മിനിറ്റ് ഐസ് ബാത്ത് ചെയ്യുക.

3) വ്യക്തമാക്കിയ ക്രമത്തിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഘടകങ്ങൾ ചേർക്കുക

*10×ക്യാപ്പിംഗ് ബഫർ: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, ആർഎൻഎ ഇപ്പോൾ ക്യാപ് ചെയ്ത് ഡൗൺസ്ട്രീം ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി തയ്യാറാണ്.

2. 5′ ടെർമിനൽ ലേബലിംഗ് പ്രതികരണം (പ്രതികരണത്തിൻ്റെ അളവ്: 20 μL)

5´ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് അടങ്ങിയ ആർഎൻഎയെ ലേബൽ ചെയ്യുന്നതിനാണ് ഈ പ്രോട്ടോക്കോൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്, അത് ആവശ്യാനുസരണം വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.ലേബൽ ഇൻകോർപ്പറേഷൻ്റെ കാര്യക്ഷമതയെ RNA: GTP യുടെ മോളാർ അനുപാതവും അതുപോലെ RNA സാമ്പിളുകളിലെ GTP ഉള്ളടക്കവും സ്വാധീനിക്കും.

1) 1.5 മില്ലി മൈക്രോഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ 14.0 µL എന്ന അന്തിമ വോള്യത്തിൽ ഉചിതമായ അളവിൽ RNA, ന്യൂക്ലീസ്-ഫ്രീ H2O എന്നിവ സംയോജിപ്പിക്കുക.

2) 65 ഡിഗ്രിയിൽ 5 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക, തുടർന്ന് 5 മിനിറ്റ് ഐസ് ബാത്ത് ചെയ്യുക.

3) വ്യക്തമാക്കിയ ക്രമത്തിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഘടകങ്ങൾ ചേർക്കുക.

** ജിടിപി മിക്സ് എന്നത് ജിടിപിയെയും ചെറിയ അളവിലുള്ള മാർക്കറുകളേയും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.GTP യുടെ ഏകാഗ്രതയ്ക്കായി, റഫർ ചെയ്യുകശ്രദ്ധിക്കുക 3.

4) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, RNA 5′ അവസാനം ഇപ്പോൾ ലേബൽ ചെയ്‌ത് ഡൗൺസ്ട്രീമിനായി തയ്യാറാണ്

അപേക്ഷകൾ

1. വിവർത്തന പരിശോധനകൾ/ഇൻ വിട്രോ വിവർത്തനത്തിന് മുമ്പ് mRNA ക്യാപ്പിംഗ്

2. mRNAയുടെ 5´ അവസാനം ലേബൽ ചെയ്യുന്നു

ഉപയോഗത്തെക്കുറിച്ചുള്ള കുറിപ്പുകൾ

1.വാക്സിനിയ ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേഷൻ ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ് ആർഎൻഎയുടെ ലായനി ചൂടാക്കുന്നത് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിൻ്റെ 5 അറ്റത്തുള്ള ദ്വിതീയ ഘടന നീക്കം ചെയ്യുന്നു.അറിയപ്പെടുന്ന ഉയർന്ന ഘടനാപരമായ 5 അറ്റങ്ങളുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾക്ക് സമയം 60 മിനിറ്റ് വരെ നീട്ടുക.

2. ക്യാപ്പിംഗ് പ്രതികരണങ്ങൾക്ക് ഉപയോഗിക്കുന്ന ആർഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ന്യൂക്ലീസ് രഹിത വെള്ളത്തിൽ സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുകയും വേണം.EDTA ഉണ്ടാകരുത്, ലായനി ലവണങ്ങൾ ഇല്ലാത്തതായിരിക്കണം.

3. 5´ അവസാനം ലേബൽ ചെയ്യുന്നതിന്, മൊത്തം GTP കോൺസൺട്രേഷൻ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിലെ mRNAയുടെ മോളാർ സാന്ദ്രതയുടെ 1-3 മടങ്ങ് ആയിരിക്കണം.

4. റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിൻ്റെ വോളിയം യഥാർത്ഥമായത് അനുസരിച്ച് മുകളിലേക്കും താഴേക്കും സ്കെയിൽ ചെയ്യാം.