PNGase F
പെപ്റ്റൈഡ്-എൻ-ഗ്ലൈക്കോസിഡേസ് എഫ് (പിഎൻജിസെ എഫ്) ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് മിക്കവാറും എല്ലാ എൻ-ലിങ്ക്ഡ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും ഫലപ്രദമായ എൻസൈമാറ്റിക് രീതിയാണ്.എൻ-ലിങ്ക്ഡ് ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്നുള്ള ഉയർന്ന മാനോസ്, ഹൈബ്രിഡ്, സങ്കീർണ്ണമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ എന്നിവയുടെ ആന്തരികമായ GlcNAc, ശതാവരി എന്നിവയുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കിടയിൽ പിളരുന്ന ഒരു അമിഡേസാണ് PNGase F.
അപേക്ഷ
പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യാൻ ഈ എൻസൈം ഉപയോഗപ്രദമാണ്.
തയ്യാറാക്കലും സ്പെസിഫിക്കേഷനും
| രൂപഭാവം | നിറമില്ലാത്ത ദ്രാവകം |
| പ്രോട്ടീൻ പരിശുദ്ധി | ≥95% (എസ്ഡിഎസ്-പേജിൽ നിന്ന്) |
| പ്രവർത്തനം | ≥500,000 U/mL |
| എക്സോഗ്ലൈക്കോസിഡേസ് | ഒരു പ്രവർത്തനവും കണ്ടെത്താനായില്ല (ND) |
| എൻഡോഗ്ലൈക്കോസിഡേസ് F1 | ND |
| എൻഡോഗ്ലൈക്കോസിഡേസ് F2 | ND |
| എൻഡോഗ്ലൈക്കോസിഡേസ് F3 | ND |
| എൻഡോഗ്ലൈക്കോസിഡേസ് എച്ച് | ND |
| പ്രോട്ടീസ് | ND |
പ്രോപ്പർട്ടികൾ
| EC നമ്പർ | 3.5.1.52(സൂക്ഷ്മജീവികളിൽ നിന്നുള്ള പുനഃസംയോജനം) |
| തന്മാത്രാ ഭാരം | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| ഐസോഇലക്ട്രിക് പോയിൻ്റ് | 8. 14 |
| ഒപ്റ്റിമൽ പി.എച്ച് | 7.0-8.0 |
| ഒപ്റ്റിമൽ താപനില | 65 °C |
| അടിവസ്ത്രത്തിൻ്റെ പ്രത്യേകത | GlcNAc, ശതാവരി അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ തമ്മിലുള്ള ഗ്ലൈക്കോസിഡിക് ബോണ്ടുകൾ വിച്ഛേദിക്കുന്നു ചിത്രം.1 |
| തിരിച്ചറിയൽ സൈറ്റുകൾ | α1-3 ഫ്യൂക്കോസ് അടങ്ങിയിട്ടില്ലെങ്കിൽ എൻ-ലിങ്ക്ഡ് ഗ്ലൈക്കാനുകൾ ചിത്രം 2 |
| ആക്ടിവേറ്ററുകൾ | ഡി.ടി.ടി |
| ഇൻഹിബിറ്റർ | എസ്.ഡി.എസ് |
| സംഭരണ താപനില | -25 ~-15 ℃ |
| ചൂട് നിഷ്ക്രിയമാക്കൽ | 1µL PNGase F അടങ്ങിയ 20µL പ്രതികരണ മിശ്രിതം 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 75 °C ഇൻകുബേഷൻ വഴി പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുന്നു. |
ചിത്രം 1 PNGase F-ൻ്റെ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് പ്രത്യേകത
ചിത്രം 2 തിരിച്ചറിയൽ PNGase F.
ആന്തരിക GlcNAc അവശിഷ്ടങ്ങൾ α1-3 ഫ്യൂക്കോസുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുമ്പോൾ, PNGase F-ന് ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് N-ലിങ്ക്ഡ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളെ വേർപെടുത്താൻ കഴിയില്ല.സസ്യങ്ങളിലും ചില ഷഡ്പദ ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീനുകളിലും ഈ മാറ്റം സാധാരണമാണ്.
Cഎതിരാളികൾ
|
| ഘടകങ്ങൾ | ഏകാഗ്രത |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീൻ ഡിനാച്ചറിംഗ് ബഫർ | 1000 µl |
| 3 | 10×ഗ്ലൈക്കോബഫർ 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
യൂണിറ്റ് നിർവചനം
ഒരു യൂണിറ്റ്(U) എന്നത് 10 µL എന്ന മൊത്തം പ്രതിപ്രവർത്തന വോളിയത്തിൽ 37°C താപനിലയിൽ 10 µg 10 μg കാർബോഹൈഡ്രേറ്റിൽ നിന്ന് 95% കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് നീക്കം ചെയ്യാൻ ആവശ്യമായ എൻസൈമിൻ്റെ അളവാണ്.
പ്രതികരണ വ്യവസ്ഥകൾ
1.1-20 μg ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീൻ ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിക്കുക, 1 µl 10×ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീൻ ഡിനാറ്ററിംഗ് ബഫറും H2O (ആവശ്യമെങ്കിൽ) ചേർത്ത് 10 µl മൊത്തം പ്രതിപ്രവർത്തന വോളിയം ഉണ്ടാക്കുക.
2.100 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 10 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, ഐസിൽ തണുപ്പിക്കുക.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ചേർത്ത് ഇളക്കുക.
4.1-2 µl PNGase F, H എന്നിവ ചേർക്കുക2O (ആവശ്യമെങ്കിൽ) 20 µl മൊത്തം പ്രതികരണ വോളിയം ഉണ്ടാക്കി മിക്സ് ചെയ്യുക.
5.60 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പ്രതികരണം ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.
6.SDS-PAGE വിശകലനത്തിനോ HPLC വിശകലനത്തിനോ വേണ്ടി.
