mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase വാക്സിനിയ mRNA ക്യാപ് 2 ´-O-Methyltransferase-ൻ്റെ ജീൻ വഹിക്കുന്ന ഒരു റീകോമ്പിനൻ്റ് E. coli സ്ട്രെയിനിൽ നിന്നാണ് ഉരുത്തിരിഞ്ഞത്.ഈ എൻസൈം ആർഎൻഎയുടെ 5 അറ്റത്തുള്ള തൊപ്പി ഘടനയോട് ചേർന്നുള്ള ആദ്യത്തെ ന്യൂക്ലിയോടൈഡിൻ്റെ 2´-O സ്ഥാനത്ത് ഒരു മീഥൈൽ ഗ്രൂപ്പിനെ ചേർക്കുന്നു. ഈ എൻസൈം S-adenosylmethionine (SAM) ഒരു മീഥൈൽ ദാതാവായി മീഥൈൽ ക്യാപ്ഡ് RNA (തൊപ്പി) ആയി ഉപയോഗിക്കുന്നു. -0) ഫലമായി ഒരു ക്യാപ്-1 ഘടന.

Cap1 ഘടനയ്ക്ക് വിവർത്തന കാര്യക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കാനും ട്രാൻസ്ഫക്ഷൻ, മൈക്രോ ഇൻജക്ഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾ എന്നിവയിൽ mRNA യുടെ ആവിഷ്കാരം മെച്ചപ്പെടുത്താനും കഴിയും. ഈ എൻസൈമിന് പ്രത്യേകമായി m7GpppN ക്യാപ് ഉള്ള RNA ആവശ്യമാണ്.ഇതിന് 5´ അറ്റത്ത് pN, ppN, pppN അല്ലെങ്കിൽ GpppN എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം RNA ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല.ക്യാപ് അനലോഗ് ഉപയോഗിച്ച് ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ വഴിയോ വാക്സിനിയ ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈം ഉപയോഗിച്ച് എൻസൈമാറ്റിക് ക്യാപ്പിംഗ് വഴിയോ ക്യാപ്ഡ് ആർഎൻഎ തയ്യാറാക്കാം.

ഘടകങ്ങൾ

mRNA ക്യാപ് 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10× ക്യാപ്പിംഗ് റിയാക്ഷൻ ബഫർ

സംഭരണം

സംഭരണത്തിനായി -25 ～- 15℃ (ആവർത്തിച്ചുള്ള ഫ്രീസ്-ഥോ സൈക്കിളുകൾ ഒഴിവാക്കുക)

സംഭരണ ​​ബഫർ

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% ഗ്ലിസറോൾ.

യൂണിറ്റ് നിർവചനം

37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 1 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ 80 എൻടി ക്യാപ്ഡ് ആർഎൻഎ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിൻ്റെ 10 പിമോളുകൾ മീഥൈലേറ്റ് ചെയ്യാൻ ആവശ്യമായ എൻസൈമിൻ്റെ അളവാണ് ഒരു യൂണിറ്റ് എന്ന് നിർവചിച്ചിരിക്കുന്നു.

ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ പരിശോധനകൾ

എക്സോന്യൂക്ലീസ്:50U of mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase with 1μg λ-Hind III ഡൈജസ്റ്റ് ഡിഎൻഎ 37 ℃ 16 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന തരത്തിൽ ഡീഗ്രേഡേഷൻ നൽകുന്നില്ല.

എൻഡോ ന്യൂക്ലീസ്: 50 U mRNA ക്യാപ് 2 ´ -O-Methyltransferase ഉള്ള 1 μg λDNA 37℃ 16 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന തരത്തിൽ ഡീഗ്രേഡേഷൻ നൽകുന്നില്ല.

നിക്കേസ്: 50U mRNA ക്യാപ് 2 ´ -O-Methyltransferase ഉള്ള 1μg pBR322 37 ℃ 16 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത് പോലെ യാതൊരു ഡീഗ്രഡേഷനും നൽകുന്നില്ല.

RNase: 50U mRNA ക്യാപ് 2 ´ -O-Methyltransferase ഉള്ള 1.6μg MS2 RNA 37 ഡിഗ്രിയിൽ 4 മണിക്കൂർ നേരം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന തരത്തിൽ ഡീഗ്രേഡേഷൻ നൽകുന്നില്ല.

E. കോളി ഡിഎൻഎ: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase സാന്നിധ്യത്തിനായി പരിശോധിക്കുന്നുE. കോളി തക്മാൻ qPCR ഉപയോഗിച്ചുള്ള ജീനോമിക് ഡിഎൻഎE. കോളി 16S rRNA ലോക്കസ്.ദിE. കോളി ജനിതക DNA മലിനീകരണം =1 ആണ്E. കോളി ജനിതകഘടന.

ബാക്ടീരിയ എൻഡോടോക്സിൻ: LAL-ടെസ്റ്റ്, ചൈനീസ് ഫാർമക്കോപ്പിയ IV 2020 പതിപ്പ് അനുസരിച്ച്, ജെൽ ലിമിറ്റ് ടെസ്റ്റ് രീതി, പൊതു നിയമം (1143).ബാക്ടീരിയ എൻഡോടോക്സിൻ ഉള്ളടക്കം =10 EU/mg ആയിരിക്കണം.

പ്രതികരണ സംവിധാനവും വ്യവസ്ഥകളും

1. 1.5 മില്ലി മൈക്രോഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ 16.0 µL എന്ന അന്തിമ വോള്യത്തിലേക്ക് ഉചിതമായ അളവിൽ ക്യാപ്ഡ് ആർഎൻഎയും ആർനേസ്-ഫ്രീ എച്ച്2ഒയും സംയോജിപ്പിക്കുക.

2. 5 മിനിറ്റ് 65℃ ചൂടാക്കുക, തുടർന്ന് 5 മിനിറ്റ് ഐസ് ബാത്ത്.

3. വ്യക്തമാക്കിയ ക്രമത്തിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഘടകങ്ങൾ ചേർക്കുക (ക്യാപ്ഡ് ആർഎൻഎയുടെ മെഥൈലേഷനായി

10 ൽ കുറവ്

*10× ക്യാപ്പിംഗ് റിയാക്ഷൻ ബഫർ: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 1 മണിക്കൂർ 37℃ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക (200 nt-ൽ താഴെയുള്ള ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിന് 2 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു).

അപേക്ഷകൾ

മൈക്രോ ഇൻജക്ഷൻ, ട്രാൻസ്ഫക്ഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കിടയിൽ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്താൻ.

ഉപയോഗത്തെക്കുറിച്ചുള്ള കുറിപ്പുകൾ

1. പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് മുമ്പ്, RNA ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ന്യൂക്ലീസ് രഹിത വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിക്കുകയും വേണം, എല്ലാ ലായനികളിലും EDTA, അയോണുകൾ എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കരുത്.

2. ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റിൻ്റെ 5'അറ്റത്തുള്ള ദ്വിതീയ ഘടന നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് 5 മിനിറ്റ് മുമ്പ് സാമ്പിൾ RNA 65℃-ൽ ചൂടാക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.സങ്കീർണ്ണമായ 5´-ടെർമിനൽ ഘടനയ്ക്കായി ഇത് 10 മിനിറ്റായി നീട്ടാം.