ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് RNA (dsRNA) ELISA KIT

ഈ കിറ്റ് ഒരു എൻസൈം-ലിങ്ക്ഡ് ഇമ്മ്യൂണോസോർബൻ്റ് അസ്സെ (ELISA) ബയോട്ടിൻ-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ സിസ്റ്റവുമായി സംയോജിപ്പിക്കുന്നു, സീക്വൻസ് പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ 60 ബേസ് ജോഡികളേക്കാൾ (ബിപി) ദൈർഘ്യമുള്ള ഡിഎസ്ആർഎൻഎയുടെ അളവ് അളക്കുന്നതിന്.പ്ലേറ്റ് ആൻ്റി-ഡിഎസ്ആർഎൻഎ ആൻ്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് മുൻകൂട്ടി പൂശിയിരിക്കുന്നു.സാമ്പിളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന dsRNA കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയും കിണറുകളിൽ പൊതിഞ്ഞ ആൻ്റിബോഡികളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.തുടർന്ന് ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ആൻ്റി ഡിഎസ്ആർഎൻഎ ആൻ്റിബോഡി ചേർക്കപ്പെടുകയും സാമ്പിളിലെ ഡിഎസ്ആർഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.കഴുകിയ ശേഷം, HRP-Streptavidin ചേർക്കുകയും ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ആൻ്റി-ഡിഎസ്ആർഎൻഎ ആൻ്റിബോഡിയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ഇൻകുബേഷൻ അൺബൗണ്ട് ചെയ്ത ശേഷം HRP-Streptavidin കഴുകി കളയുന്നു.പിന്നീട് ടിഎംബി സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ലായനി ചേർത്ത് HRP ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും അമ്ല സ്റ്റോപ്പ് ലായനി ചേർത്ത ശേഷം മഞ്ഞയായി മാറിയ നീല നിറമുള്ള ഉൽപ്പന്നം നിർമ്മിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.മഞ്ഞയുടെ സാന്ദ്രത പ്ലേറ്റിൽ പിടിച്ചെടുക്കുന്ന ഡിഎസ്ആർഎൻഎയുടെ ടാർഗെറ്റ് അളവിന് ആനുപാതികമാണ്.ആഗിരണം 450 nm ആണ്.

അപേക്ഷ

ഈ കിറ്റ് ശേഷിക്കുന്ന dsRNA യുടെ അളവ് അളക്കുന്നതിനുള്ളതാണ്.

കിറ്റ് ഘടകങ്ങൾ

സംഭരണവും സ്ഥിരതയും

1. ഉപയോഗിക്കാത്ത കിറ്റിന്: മുഴുവൻ കിറ്റും ഷെൽഫ് ലൈഫിൽ 2~8 ഡിഗ്രിയിൽ സൂക്ഷിക്കാം.സ്റ്റോറേജ് സ്ഥിരതയ്ക്കായി ശക്തമായ വെളിച്ചം ഒഴിവാക്കണം.

2. ഉപയോഗിച്ച കിറ്റിന്: മൈക്രോപ്ലേറ്റ് തുറന്ന് കഴിഞ്ഞാൽ, ഉപയോഗിക്കാത്ത കിണറുകൾ പ്ലേറ്റ് സീലർ ഉപയോഗിച്ച് മൂടുക, ഡെസിക്കൻ്റ് പായ്ക്ക് അടങ്ങിയ ഫോയിൽ പൗച്ചിലേക്ക് മടങ്ങുക, ഫോയിൽ പൗച്ച് സിപ്പ്-സീൽ ചെയ്ത് 2~8℃-ലേക്ക് എത്രയും വേഗം മടങ്ങുക.മറ്റ് റിയാഗൻ്റുകൾ ഉപയോഗത്തിന് ശേഷം കഴിയുന്നതും വേഗം 2~8℃ ലേക്ക് തിരികെ നൽകണം.

ആവശ്യമുള്ള മെറ്റീരിയലുകൾ, പക്ഷേ വിതരണം ചെയ്തിട്ടില്ല

1. 450±10nm ഫിൽട്ടറുള്ള മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡർ (450, 650 nm തരംഗദൈർഘ്യത്തിൽ കണ്ടെത്താൻ കഴിയുമെങ്കിൽ നല്ലത്).

2. മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഷേക്കർ.

3. RNase-രഹിത നുറുങ്ങുകളും അപകേന്ദ്ര ട്യൂബുകളും.

ഓപ്പറേഷൻ ഫ്ലോചാർട്ട്

നിങ്ങൾ ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്

1. ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് എല്ലാ കിറ്റ് ഘടകങ്ങളും സാമ്പിളുകളും ഊഷ്മാവിൽ (18-25℃) കൊണ്ടുവരിക.കിറ്റ് ഒറ്റത്തവണ ഉപയോഗിക്കാനായില്ലെങ്കിൽ, നിലവിലെ പരീക്ഷണത്തിനായി സ്ട്രിപ്പുകളും റിയാക്ടറുകളും മാത്രം പുറത്തെടുക്കുക, ബാക്കിയുള്ള സ്ട്രിപ്പുകളും റിയാക്ടറുകളും ആവശ്യമായ അവസ്ഥയിൽ വയ്ക്കുക.

2. വാഷ് ബഫർ: 800mL 1× വാഷ് ബഫർ തയ്യാറാക്കാൻ 40mL 20× കേന്ദ്രീകൃത വാഷ് ബഫർ 760mL ഡീയോണൈസ്ഡ് അല്ലെങ്കിൽ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിക്കുക.

3. സ്റ്റാൻഡേർഡ്: ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് സ്റ്റോക്ക് ലായനി ഹ്രസ്വമായി സ്പിൻ ചെയ്യുക അല്ലെങ്കിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക.നൽകിയിരിക്കുന്ന നാല് മാനദണ്ഡങ്ങളുടെ സാന്ദ്രത 5ng/μL ആണ്.UTP, pUTP dsRNA മാനദണ്ഡങ്ങൾക്കായി, സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് വരയ്ക്കുന്നതിന് സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷൻ 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL എന്നതിലേക്ക് നേർപ്പിക്കുക.N1-Me-pUTP dsRNA മാനദണ്ഡങ്ങൾക്കായി, സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് വരയ്ക്കുന്നതിന് സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷൻ 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL-ലേക്ക് STE ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിക്കുക.5-OMe-UTP dsRNA സ്റ്റാൻഡേർഡിനായി, സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് വരയ്ക്കുന്നതിന് സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷൻ 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL എന്നതിലേക്ക് STE ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിക്കുക.ഇനിപ്പറയുന്ന ചാർട്ടുകളായി മാനദണ്ഡങ്ങൾ നേർപ്പിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു:

4. ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഡിറ്റക്ഷൻ ആൻ്റിബോഡിയും എച്ച്ആർപി-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ വർക്കിംഗ് സൊല്യൂഷനും: ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് സ്റ്റോക്ക് ലായനി ഹ്രസ്വമായി സ്പിൻ ചെയ്യുക അല്ലെങ്കിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക.ഡില്യൂഷൻ ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് അവയെ പ്രവർത്തന സാന്ദ്രതയിലേക്ക് നേർപ്പിക്കുക.

5. ടിഎംബി സബ്‌സ്‌റ്റേറ്റ്: അണുവിമുക്തമാക്കിയ നുറുങ്ങുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ലായനിയുടെ ആവശ്യമായ അളവ് ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്യുക, ശേഷിക്കുന്ന ലായനി വീണ്ടും കുപ്പിയിലേക്ക് വലിച്ചെറിയരുത്.ടിഎംബി സബ്‌സ്‌റ്റേറ്റ് പ്രകാശത്തോട് സംവേദനക്ഷമതയുള്ളതാണ്, ടിഎംബി സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിനെ ദീർഘനേരം പ്രകാശത്തിലേക്ക് എക്സ്പോഷർ ചെയ്യരുത്.

പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു

1. പരിശോധനയ്ക്ക് ആവശ്യമായ സ്ട്രിപ്പുകളുടെ എണ്ണം നിർണ്ണയിക്കുക.ഉപയോഗത്തിനായി ഫ്രെയിമുകളിൽ സ്ട്രിപ്പുകൾ തിരുകുക.ഈ പരിശോധനയിൽ ഉപയോഗിക്കാത്ത ബാക്കിയുള്ള പ്ലേറ്റ് സ്ട്രിപ്പുകൾ ഡെസിക്കൻ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ബാഗിൽ വീണ്ടും പാക്ക് ചെയ്യണം.ശീതീകരിച്ച സംഭരണത്തിനായി ബാഗ് കർശനമായി അടയ്ക്കുക.

2. 100μL ഓരോന്നിനും സ്റ്റാൻഡേർഡ്, ബ്ലാങ്ക്, സാമ്പിളുകൾ എന്നിവയുടെ നേർപ്പണം ഉചിതമായ കിണറുകളിൽ ചേർക്കുക.പ്ലേറ്റ് സീലർ ഉപയോഗിച്ച് മൂടുക.500rpm-ൽ കുലുക്കി ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.കൃത്യമായ പരിശോധനയ്ക്കായി സാമ്പിളുകൾ STE ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് ലയിപ്പിച്ചിരിക്കണം.

3. വാഷ് സ്റ്റെപ്പ്: ലായനി ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്ത് ഓരോ കിണറിലേക്കും 250μL വാഷ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി 30 സെ.ആഗിരണം ചെയ്യാവുന്ന പേപ്പറിലേക്ക് പ്ലേറ്റ് പൊട്ടിച്ച് വാഷ് ബഫർ പൂർണ്ണമായും ഉപേക്ഷിക്കുക.പൂർണ്ണമായും 4 തവണ കഴുകുക.

4. ഓരോ കിണറിലേക്കും 100μL ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഡിറ്റക്ഷൻ ആൻ്റിബോഡി വർക്കിംഗ് സൊല്യൂഷൻ ചേർക്കുക.പ്ലേറ്റ് സീലർ ഉപയോഗിച്ച് മൂടുക.500rpm-ൽ കുലുക്കി ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.

5. വാഷ് ഘട്ടം ആവർത്തിക്കുക.

6. ഓരോ കിണറിലും 100μL HRP-streptavidin വർക്കിംഗ് സൊല്യൂഷൻ ചേർക്കുക.പ്ലേറ്റ് സീലർ ഉപയോഗിച്ച് മൂടുക.500 ആർപിഎമ്മിൽ കുലുക്കി ഊഷ്മാവിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.

7. വീണ്ടും കഴുകൽ ഘട്ടം ആവർത്തിക്കുക.

8. ഓരോ കിണറിലേക്കും 100μL TMB സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ലായനി ചേർക്കുക.പ്ലേറ്റ് സീലർ ഉപയോഗിച്ച് മൂടുക.RT പ്രൊട്ടക്ടിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ലായനി ചേർക്കുന്നതിലൂടെ ദ്രാവകം നീലയായി മാറും.

9. ഓരോ കിണറിലേക്കും 50μL സ്റ്റോപ്പ് ലായനി ചേർക്കുക.സ്റ്റോപ്പ് ലായനി ചേർക്കുന്നതിലൂടെ ദ്രാവകം മഞ്ഞനിറമാകും.തുടർന്ന് മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡർ പ്രവർത്തിപ്പിച്ച് 450nm-ൽ മെഷർമെൻ്റ് നടത്തുക.

ഫലങ്ങളുടെ കണക്കുകൂട്ടൽ

1. ഓരോ സ്റ്റാൻഡേർഡ്, കൺട്രോൾ, സാമ്പിളുകൾ എന്നിവയുടെ ഡ്യൂപ്ലിക്കേറ്റ് റീഡിംഗുകളുടെ ശരാശരി കണക്കാക്കി ശരാശരി പൂജ്യം സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഒപ്റ്റിക്കൽ ഡെൻസിറ്റി കുറയ്ക്കുക.ലംബമായ (Y) അക്ഷത്തിൽ ആഗിരണം ചെയ്യപ്പെടുന്ന ഒരു സാധാരണ വക്രവും തിരശ്ചീനമായ (X)അക്ഷത്തിൽ dsRNA സാന്ദ്രതയും നിർമ്മിക്കുക.

2. കർവ് എക്‌സ്‌പെർട്ട് 1.3 അല്ലെങ്കിൽ എലിസ കാൽക് പോലുള്ള കമ്പ്യൂട്ടർ അധിഷ്‌ഠിത കർവ് ഫിറ്റിംഗ് സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് 5 അല്ലെങ്കിൽ 4 പാരാമീറ്റർ നോൺ-ലീനിയർ ഫിറ്റ് മോഡലിൽ കണക്കുകൂട്ടൽ നടത്താൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

പ്രകടനം

1. സംവേദനക്ഷമത:

കണ്ടെത്തലിൻ്റെ താഴ്ന്ന പരിധി: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA യ്ക്ക്).

കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള പരിധി:0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA യ്ക്ക്).

2. പ്രിസിഷൻ: ഇൻട്രാ-അസ്സേയുടെ സിവി ≤10%, ഇൻ്റർ-അസ്സേയുടെ സിവി ≤10%

3. വീണ്ടെടുക്കൽ:80%~120%

4.രേഖീയത:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(N1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA യ്ക്ക്).

പരിഗണനകൾ

1. TMB പ്രതികരണ താപനിലയും സമയവും നിർണ്ണായകമാണ്, നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് കർശനമായി അവയെ നിയന്ത്രിക്കുക.

2. നല്ല പരിശോധനാ പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും സംവേദനക്ഷമതയും കൈവരിക്കുന്നതിന്, അധിക പ്രതികരിക്കാത്ത റിയാഗൻ്റുകൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി പ്ലേറ്റുകൾ ശരിയായി കഴുകേണ്ടത് അത്യാവശ്യമാണ്.

3. എല്ലാ റിയാക്ടറുകളും ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് നന്നായി മിക്സ് ചെയ്യണം, കൂടാതെ സാമ്പിൾ അല്ലെങ്കിൽ റിയാജൻ്റ് കൂട്ടിച്ചേർക്കുമ്പോൾ ബംബിളുകൾ ഒഴിവാക്കുക.

4. സാന്ദ്രീകൃത വാഷ് ബഫറിൽ (20x) പരലുകൾ രൂപപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ, 37℃ വരെ ചൂടാക്കി പരലുകൾ പൂർണ്ണമായും അലിഞ്ഞുപോകുന്നതുവരെ സൌമ്യമായി ഇളക്കുക.

5. സോഡിയം അസൈഡ് (NaN3) അടങ്ങിയ സാമ്പിളുകളുടെ പരിശോധന ഒഴിവാക്കുക, കാരണം ഇത് HRP പ്രവർത്തനത്തെ നശിപ്പിക്കും, അതിൻ്റെ ഫലമായി dsRNA യുടെ അളവ് കുറയും.

6. പരിശോധനയ്ക്കിടെ RNase മലിനീകരണം ഒഴിവാക്കുക.

7. സ്റ്റാൻഡേർഡ്/സാമ്പിൾ, ഡിറ്റക്ഷൻ ആൻ്റിബോഡി, എസ്എ-എച്ച്ആർപി എന്നിവയും കുലുങ്ങാതെ RT-ൽ നടത്താം, എന്നാൽ ഇത് ഡിറ്റക്ഷൻ സെൻസിറ്റിവിറ്റി ഒരു മടങ്ങ് കുറയാൻ കാരണമായേക്കാം.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, UTP, pUTP dsRNA മാനദണ്ഡങ്ങൾ 2pg/μL-ൽ നിന്ന് നേർപ്പിക്കണമെന്നും N1-Me-pUTP dsRNA മാനദണ്ഡങ്ങൾ 4pg/μL-ൽ നിന്ന് നേർപ്പിക്കണമെന്നും 5-OMe-UTP dsRNA നിലവാരം 8pg/μL-ൽ നിന്ന് നേർപ്പിക്കണമെന്നും ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.കൂടാതെ, ഊഷ്മാവിൽ 60 മിനിറ്റ് HRP-സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ വർക്കിംഗ് ലായനി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.ഫ്ലാസ്ക് ഷേക്കർ ഉപയോഗിക്കരുത്, കാരണം ഫ്ലാസ്ക് ഷേക്കർ തെറ്റായ ഫലത്തിന് കാരണമായേക്കാം.

സാധാരണ ഫലം

1. സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് ഡാറ്റ

2. സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് കണക്കുകൂട്ടൽ

3. ലൈനർ കണ്ടെത്തൽ പരിധി: 0.0312- 1pg/μL